Гипотермическое сохранениe биологических тканей и клеток

Оглавление Дорога к бессмертию Бессмертие и религия Бессмертие в древнем Египте Бессмертие в древней Греции Бессмертие в Индуизме Бессмертие в Буддизме Бессмертие в Иудаизме Бессмертие в Христианстве Бессмертие в Исламе Бессмертие в Зороастризме Бессмертие в Синтоизме Бессмертие в Даосизме Бессмертие в религиях заключение Философия бессмертия Иммортализм Трансгуманизм Бессмертие и наука История анабиоза Анабиоз в природе Диапауза Оцепенение Спячка Анабиоз, различные стадии Анабиоз человека Смерть Философия смерти Танатология Кора головного мозга Анатомия коры головного мозга Физиология коры головного мозга Бессмертие и анабиоз Анабиоз, медицина и биология Дегидратация Искусственная гипотермия Клатраты ксенона Анабиоз клатратный Анабиоз и экономика Цена анабиоза Анабиоз и закон Анабиоз в Антарктиде Техническое обеспечение анабиоза Бессмертие и вера Библиотека Ordo Deus Каталог заглавий Каталог авторский Каталог заболеваний Каталог систематический Общий терминологический словарь Словарь естественнонаучных и технических терминов Словарь медицинских терминов Краткие сведения об упоминаемых авторах Рецепты эликсиров бессмертия Избранные афоризмы Список литературы и других источников информации Контактная страница Ordo Deus План развития Ordo Deus Организация - Ordo Deus Устав Ordo Deus Завет Ordo Deus Хроники Ordo Deus Полный свод знаний Коллектив Ordo Deus

Гипотермическое сохранениe биологических тканей и клеток Приносим наши извинения за качество перевода, он сделан Гугл переводчиком, исходный текс Вы найдёте ниже. Первоисточник: http://www.patentstorm.us/applications/20090286220/fulltext.html Связаться с Нами США патенты доступны с 1976 года по настоящее время. США заявки на патенты доступны с 2005 года по настоящее время или попробуйте расширенный поиск. Патент США 20090286220 - Гипотермическое сохранения биологических тканей и клеток Приложение 20090286220 Подано 7 мая 2009 года. Опубликовано 19 ноября 2009. Аннотация Описание претензий Полный текст Изобретатели Шелег, Сергей Владимирович Хиксон, JR., Хью L. Коэн, Брюс Сваровски, Сергей Александрович Правопреемник IBPT CORPORATION Классы США 435/1.3, 435/1.1 Адвокат, агент или фирма LOUIS Ventre, JR Международного класса A01N 1/02 Выпущено Номер патента: 8124329 Текст тезисов Метод гипотермии сохранение биологической ткани для последующего восстановления жизнеспособного государства включает в себя промывку биологической ткани с газовой смеси гексафторида серы или ксенон и кислород. Гексафторида серы или ксенон в концентрации в смеси с 75 моль до 95 моль. Метод включает в себя давления на биологические ткани, желательно изотермически, смесью под давлением, которые станут клатратов в биологические ткани на желаемую температуру хранения в диапазоне от +1° С до +5° С. Метод включает в себя шаг охлаждения биологических тканей, желательно изобарически к желаемой температуры хранения. Дополнительные шаги для дальнейшего охлаждения не холоднее, чем -20° С и для разгерметизации предоставляются, а также шаги для восстановления hypothermically сохранились биологические ткани на жизнеспособное государство, предпочтительно с использованием смеси добычи газа. Претензии 1. Метод гипотермии сохранение биологической ткани для последующего восстановления в жизнеспособном состоянии, включающий следующие этапы: промывка биологической ткани с газом клатрата вызывающие состоящий из смеси клатрата формирование газов и кислорода, которых клатрата формирования газ выбирается из группы, состоящей из гексафторида серы, и, ксенон, которой клатрата формирования газа в концентрации в смеси с выбранным в пределах около 75 моль до 95 моль процентов, и, где промывка вытесняет газов, окружающих биологические ткани клатратов газов вызывающих; давления на биологические ткани с газом, вызывающие клатратов на давление, которое образуют клатраты в биологические ткани на желаемую температуру хранения в диапазоне от плюс одного градуса по Цельсию до плюс 5 градусов по Цельсию, и, охлаждение биологической ткани на желаемую температуру хранения. 2. Способ по п.1 дополнительно включающий следующие этапы: охлаждения биологических тканей на второй желаемой температуры хранения теплее около минус 20 градусов по Цельсию, в которых второй желаемого температура хранения, на которой клатратов будут формироваться и остаются в ткани из клатратов вызывая газа на второе давление хранения от 15 фунтов на квадратный дюйм калибра и 100 фунтов на квадратный дюйм датчика; и, подвергая биологические ткани на второй давления хранения. 3. Способ по п. 2 причем вторая давление хранения составляет около 15 фунтов на квадратный дюйм колеи. 4. Метод восстановления жизнеспособного состояния биологических тканей hypothermically сохранились в соответствии с п. 2, метод восстановления, включающий стадии: промывку биологическую ткань смесью восстановления газ, состоящий из: гелий в концентрации в смеси газов восстановления в течение от 90 моль до 95 моль процентов, и, кислород в концентрации в смеси газов восстановление в пределах около 5 моль до 10 моль, которых промывка вытесняет газ клатрата вызывающие окружающих биологических тканей с восстановлением газовой смеси; подвергая биологические ткани для восстановления газа на восстановление давления, что позволяет клатратов газов вызывающих формирование клатратов в биологической ткани при температуре выше нуля градусов Цельсия; потепления биологической ткани в первом восстановления температуры выше нуля градусов Цельсия; разгерметизации биологической ткани в то время как потепление биологической ткани на давление и температуру, которая восстанавливает биологическую ткань в жизнеспособном состоянии.

5. Способ по п. 1, где давление в диапазоне от около 75 фунтов на квадратный дюйм калибровочных до 100 фунтов на квадратный дюйм колеи.

6. Способ по п. 1, в котором шаг давления на биологические ткани производится примерно изотермически.

7. Способ по п. 1, в котором шаг охлаждения биологических образцов тканей производится примерно изобарически.

8. Метод восстановления жизнеспособного состояния биологических тканей hypothermically сохранились в соответствии с п. 1, метод восстановления, включающий стадии: промывку биологическую ткань смесью восстановления газ, состоящий из: гелий в концентрации в смеси в диапазоне от 90 мольных процентов до 95 мольных процентов, и, кислород в концентрации в смеси в диапазоне около 5 моль до 10 моль, которых промывка происходит при давлении в диапазоне от 100 фунтов на квадратный дюйм абсолютного до 120 фунтов на квадратный дюйм абсолютного и, сбрасывая давление в биологической ткани при нагревании биологической ткани на давление и температуру, которая восстанавливает ткани жизнеспособного государства.

9. Метод восстановления жизнеспособного состояния биологических тканей hypothermically сохранились в соответствии с п. 1 использованием гексафторида серы в качестве клатрат формирования газ, метод восстановления включает стадию разгерметизации биологической ткани при нагревании биологической ткани на давление и температуру, что восстанавливает ткани жизнеспособного государства, которых темпы потепления достаточно, чтобы предотвратить образование пузырей серы гексафторид в биологических тканях.

Описание

Перекрестная ссылка соответствующих применений [0001]. Это приложение утверждает в пользу США предварительной заявке 61/071, 730, поданной 14 мая 2008 года, который здесь в качестве ссылки.

Область техники [0002] Настоящее изобретение включает в себя метод гипотермии сохранение биологической ткани в жизнеспособном состоянии в управляемый процесс охлаждения в присутствии химических агентов, что сводит к минимуму повреждения клеток от охлаждения.

Предшествующий уровень техники

[0003] Биологические ткани, или просто ткань, используемый здесь, включает в себя множество клеток или клеточного материала, которые выполняют биологическую функцию. Любое растение или животное, ткань входит. Животное органов или целых животных, таких, как планарии, включены. Клетки не обязательно совпадают, но желательно одного и того же происхождения.

[0004] Основным механизмом хранения, занятых в этом изобретении используется температура хранения ткани выше нуля градусов по Цельсию (т. е. выше точки замерзания воды при атмосферном давлении) в присутствии газообразного химического вещества. Ткань остается жизнеспособной в длинный или короткий срок хранения, по существу, зимующих с значительно снижается биологическая функция. Этот процесс позволяет ткани, которые затем будут восстановлены на жизнеспособное государство, то есть в состояние с нормальной биологической функции.

[0005] Настоящее изобретение также может быть использован для хранения биологических тканей в определенном диапазоне температур ниже нуля, с помощью этой же газообразный химический агент. Эти варианты также поддерживать жизнеспособные ткани, которая способна восстановление нормальной функции ткани, когда восстановился выше нуля температур.

[0006] обычные процессы, которые стремятся сохранить ткани при низкой температуре почти включают замораживание хранения; обычные стеклования, так и обычные криоконсервации. Ни учит процесс изобретения и все страдают от общей ненадлежащее исполнение в жизнеспособный хранения и восстановления в состояние нормальной функции.

[0007] Понижение температуры в качестве консерванта биологических тканей известных в данной области. См., например, патент США. Номер 5791151, который использует почти температуры замерзания кислорода в окружающей среде. Тем не менее, поддержание жизнеспособности тканей и восстановления тканей нормальной функции с учениями в известном уровне техники, является проблематичным.

[0008] До процессах искусства обычно используют жидкий полярных органических соединений в решение заливать биологической ткани. Эти обычные процессы не являются обратимыми в том, что они не могут быть использованы для восстановления тканей на жизнь, хотя редкие исключения наблюдаются в природе, которые связаны, например, стеклования полиолов (например, насекомых, земноводных) или тепловой белков гистерезиса (насекомые, рыбы). Смотрите, Флетчер GL, CL и Хью Дэвис PL, антифриза белков костистых рыб. Анну Rev Физиология, 63 (2001) 359-590; Грэм Лос-Анджелес, Лю YC, Уолкер К. Дэвис и PL, Гиперактивные белки антифриза из жуков. Природа, 388 (1997) 727-728. Данный метод не использует жидкость, а скорее использует конкретный газообразного химического вещества в конкретном процессе, что повышает жизнеспособность биологических тканей в кратко- и долгосрочного хранения и усиливает восстановление тканей, что в случае необходимости.

[0009] Рядом замораживания хранения стремится сохранить органов за счет снижения их температурой, близкой к точке замерзания воды. См., например, патент США. Номер 7029839. Рядом замораживания хранения включает перфузии тканей с водным раствором, содержащим, которые подавляют защитные точки замерзания раствора, так, что ткань может храниться при низкой температуре водной жидкости в клетках в жидком состоянии. Примерами жидких полярных органических соединений, используемых в качестве обычных средств защиты являются диметилсульфоксид, glygerol, этиленгликоль и пропиленгликоль. Обычные защитные может функционировать за счет связывания воды благодаря сочетанию гидрофильных и гидрофобных взаимодействий в разных точках молекулы.

[0010] обычных средств защиты могут возникнуть проблемы при использовании на больших кусков ткани, такие проблемы, как правило, связано с неравномерным распределением средств защиты в тканях. Обычные защитные обычно медленно диффундируют и проходят через клеточные мембраны и гематоэнцефалический барьер, плохо или совсем нет. Кроме того, большое количество средств защиты могут потребоваться.

[0011] Как правило, обычные защитные связываться с около двух молей воды на моль защитным. При использовании в необходимых количествах связывать воду обычных средств защиты могут быть токсичными для клеток. Почти замораживания хранения процесс идет медленно и требует высокой концентрации потенциально вредных химических веществ защитное быть внесены и удаляется из тканей.

[0012] В целом, сохранение биологических тканей за счет снижения его температуры ниже точки замерзания является деструктивным клетчатки, когда кристаллических форм льда в клетках (внутриклеточная) и вокруг клеток (внеклеточный) в качестве жидкой воды в биологических тканях переход к твердой фазе (лед). Механизм замораживания ущерб в живой ткани объясняется главным образом двумя процессами.

[0013] Первый процесс замораживания вызывающих повреждение связано с образованием льда в межклеточных пространствах. Давления паров льда меньше, чем давление пара растворенного вещества воды в окружающие клетки, и как тепло отводится на точке замерзания растворов, кристаллы льда растут между клетками, извлечение воды из них. Как кристаллы льда растут, объем клеток уменьшается, и клетки дробятся между кристаллами льда.

[0014] Второй процесс вызывает замораживание ущерб включает в себя концентрацию растворенных веществ в воде остается в клетках, как клетки сокращаться. Повышенная концентрация растворенных веществ повышает внутриклеточный ионной силы и препятствует организации белков и других межклеточных структур. В конце концов, концентрация растворенного вещества в клетках достигает эвтектической и замерзает. Конечное состояние замороженной ткани чистого льда в межклеточном пространстве, а также смесь концентрированных клеточных компонентов в лед и связанной воды в клетках.

[0015] Больше всего повреждений в тканях происходят во время разогревания и реперфузии криоконсервированных биологических тканей, таких как органы, процесс его развития занимает много времени. Изменения включают в себя конденсацию хроматина, крупные капли липидов, и частично разрушены плазматической мембраны, эти изменения можно увидеть на электронной микроскопии (которая может быть следствием осмотического экскурсии, понесенные во время замораживания и оттаивания цикла; утечки митохондриях могут вызвать апоптоз как а).

[0016] повреждение биологических тканей при замораживании вызывает, к тому же температура из-за стресса к снижению температуры себя, следующие процессы: необратимые изменения биологических мембран при обезвоживании из клеток и поверхности оболочек, вызванных замораживанием процесса разрушения потери в избирательной проницаемости, а также, физической деформации и гибели клетки. Световая микроскопия не показывают раннее замерзание повреждения клеток. Изобретение позволяет избежать таких убытков.

[0017] Обычные стеклования предполагает использование обычного криопротектора решение и криогенных температурах. См., например, патент США. Номер 4559298. Концентрированный водный раствор криопротектора может позволить затвердевания без образования кристаллов льда. То есть, стеклования может включать вызывая переход водной жидкости в аморфное твердой фазы в обеих внутриклеточных и внеклеточных пространствах тканей путем охлаждения до криогенных температур с использованием обычных криопротектора, такие как глицерин. Тем не менее, стеклования требует пропитки биологических тканей с высокой концентрацией токсичных химических веществ, которые криозащитной способствовать стекловидное состояние.

[0018] Хотя стеклования можно избежать образования льда, альтернативные возможные механизмы повреждения связаны с аморфном состоянии не выявлено. Расстеклование (образование льда в биологических тканях во время разогревания) является основным препятствием на пути успешной витрификации органов и их последующего восстановления. Витрификации не удалось успешно сохранить и вернуться в жизнеспособном состоянии внутренних органов млекопитающих.

[0019] Обычные криоконсервации может включать в себя использование жидкого криопротектора решения, чтобы предотвратить образование внутриклеточных кристаллов льда, позволяя при этом кристаллы льда формируются в внеклеточных областях. В дополнение к использованию потенциально токсичных химических веществ защитное обычные стеклования и традиционные методы криоконсервации клеток может привести пройти изменения объема во время стеклования или замораживанию, что приводит к механическим нагрузкам достаточно, чтобы вызвать растрескивание и разрушение клеток.

[0020] Использование ксенона в криоконсервации обсуждался П. В. Щербаков и V.1. Telpuhov. См. P.V. Щербаков и V.1. Telpuhov, Химия и жизнь, т.8 (2006), стр. 34-39 (на русском). Кроме того, русский патент RU2268590 к Щербаков и др.. (Опубликован 27 января 2006 с английского языка Аннотация) обсуждает насыщения тканей с примесью ксенона, криптона и аргона, заставляя воду из тканей с этой смесью инертных газов под давлением при охлаждении до -43° С, и снижение давления атмосферного давления и продолжает охлаждаться до -196° C. Изобретение не использует криоконсервации температуры, как учил Щербаков. Давление газовой смеси благородных представлена в Щербаков публикации не позволяют достаточно воды, чтобы быть связанным в клетках, чтобы обеспечить достаточное для регидратации обмен на перезагрузку. Настоящее изобретение использует специфическую смесь газа и определенной концентрации не учат в Щербаков публикаций. Кроме того, Щербаков публикации не представляют метод подходит для хранения жизнеспособной ткани способны к восстановлению жизнеспособного государства, как включены в настоящее изобретение.

Сущность изобретения

[0021] метод гипотермии сохранение биологической ткани для последующего восстановления жизнеспособного государства описано. Метод включает в себя этап промывки биологических тканей для замещения газа в среде, окружающей биологической ткани. Промывка газа газовой смеси гексафторида серы или ксенон и кислород. Гексафторида серы или ксенон в концентрации в смеси в диапазоне около 75 мольных процентов до 95 моль. Метод включает в себя этап давления на биологические ткани с газовой смесью под давлением, которые станут клатратов в биологические ткани на желаемую температуру хранения в диапазоне от плюс одного градуса по Цельсию до плюс 5 градусов по Цельсию. Это давление в диапазоне от 75 до 100 фунтов на квадратный дюйм (121) и предпочтительно достигается при сохранении биологической ткани примерно в той же температуре, то есть, изотермически (122). Метод включает в себя этап охлаждения биологических тканей к желаемой температуры хранения и предпочтительно охлаждается при сохранении биологической ткани на примерно постоянном давлении, то есть изобарически.

[0022] Дополнительные шаги могут быть использованы в дальнейшем охлаждении биологической ткани на второй желаемой температуры хранения теплее около минус 20 градусов по Цельсию, а затем сбросить давление в биологических тканях. Вторым целевым температура хранения, на которой клатратов будут формироваться и остаются в тканях из газовой вызывающие клатратов на втором давление хранения от 15 фунтов на квадратный дюйм датчик, и 100 фунтов на квадратный дюйм колеи. Разгерметизация предпочтительно, чтобы атмосферное давление около 15 фунтов на квадратный дюйм колеи (151).

[0023] Изобретение дополнительно включает в себя две дальнейшие шаги для восстановления биологических тканей из сохранившихся hypothermically государства. Один из таких шагов включает в себя промывку биологические ткани для удаления газовой смеси. Промывка осуществляется смесью восстановления газ первый компонент, выбранный из группы, состоящей из гелия, инертных газов, азота и сочетание этих и кислород. Первый компонент находится на парциальное давление около 90 фунтов на квадратный дюйм в смеси. Второй такой шаг включает в себя нагревание биологической ткани на восстановление температуры, восстанавливает ткани жизнеспособного государства.

Выгодное влияние изобретения

[0024] Гипотермическое сохранение в соответствии с настоящим изобретением сохраняет биологические ткани в жизнеспособном состоянии и позволяет нагревательных биологических тканей для восстановления функции тканей при нормальных температуре и давлении функционирования.

[0025] Гипотермическое сохранение в соответствии с настоящим изобретением является простым по сравнению с менее функциональными методами, которые требуют использования криоконсервации решение.

[0026] Гипотермическое сохранение в соответствии с настоящим изобретением является недорогой по сравнению с менее функциональной обычных процессов стеклования, которые используют дорогие химические вещества, как синтетический лед блокирование соединений.

[0027] Гипотермическое сохранение в соответствии с настоящим изобретением не является токсичным для биологических объектов, в отличие от обычных криоконсервации и витрификации процессов.

[0028] Гипотермическое сохранения биологических тканей в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы для сохранения биологических образцов, для которых не обычный метод длительного хранения, такой, как человеческий компонентов крови для переливания, например, человеческие тромбоциты крови и человеческих органов для Трансплантация, таких как сердце, почки и печень. Другие применения гипотермии сохранение биологической ткани включает высококачественный хранения продуктов, таких как морепродукты.

Краткое описание чертежей

Чертежи и рисунки Вы можете заказать на сайте патентного бюро США – http://www.patentstorm.us/applications/20090286220/fulltext.html

[0029] рисунки показывают предпочтительные варианты изобретения.

[0030] фиг. 1 иллюстрирует предпочтительные варианты осуществления процесса гипотермии сохранение биологической ткани в соответствии с изобретением.

[0031] фиг. 2 иллюстрирует предпочтительные варианты процесс восстановления биологических тканей hypothermically сохранены в соответствии с изобретением.

[0032] фиг. 3 представлен график зависимости давления от температуры, которая иллюстрирует шаги процесса для гипотермии сохранение и восстановление биологического ткани в соответствии с изобретением.

Описания вариантов

[0033] воплощения изобретения подробно обсуждаются ниже. В описании вариантах специфической терминологии используется для ясности. Тем не менее, изобретение не должно ограничиваться специфической терминологии так выбрали. Специалист в данной области техники будет понятно, что другие равноценные части могут быть использованы и другие методы, разработанные без расстаться с духом и объема изобретения.

[0034] Настоящее изобретение включает в себя метод краткосрочной и долгосрочной гипотермии сохранения биологических тканей и клеток, которые используют газовую смесь, что секвестров воду в клетках клатратных гидратов газа как клетки охлаждаются, в результате чего вода недоступна для формирования кристаллов льда в межклеточное пространство.

[0035] фиг. 1 иллюстрирует предпочтительные варианты осуществления процесса гипотермии сохранение биологической ткани в соответствии с изобретением. Сплошные линии связи подключить необходимые шаги и пунктирные линии связи подключать дополнительные шаги.

[0036] окно назначенный (100) объясняет, что изобретение представляет собой способ или метод гипотермии сохранение биологической ткани для последующего восстановления жизнеспособного государства. Изобретение включает в себя множество этапов, которые, когда контекст позволяет, могут быть выполнены в любом порядке.

[0037] промывки шаг (110) включает в себя промывку биологической ткани с газом клатрата вызывающие состоящий из смеси клатрата формирование газов и кислорода. Клатрата формирования газ или гексафторид серы или ксенон. Клатрата формирование газа в концентрации в смеси с 75 моль до 95 моль. Промывка вытесняет газы окружающей биологической ткани с клатратов газов вызывающих.

[0038] В этом термин «клатрат формирования газ включает ксенон или гексафторид серы. Именно эти два специальных газов, которые были протестированы и обеспечивают желаемый результат образования клатратных газогидратов в условиях, предназначенных для изобретения.

[0039] Термин «клатрата вызывающие газ» включает в себя смесь из одной из двух клатратов формирования газов (ксенона или гексафторид серы) и кислорода. Таким образом, «клатрата вызывающие газ» включает в себя смесь ксенона и кислорода или смеси гексафторида серы и кислорода. Серы гексафторид может иметь преимущества по сравнению с ксеноном как клатратных формирования газ. Так, например, гексафторид серы является менее дорогостоящим, чем ксенон. Это может позволить гипотермии сохранения биологического ткани с использованием гексафторида серы в более широком масштабе, чем практическое значение для сохранения гипотермии использовании ксенона. Серы гексафторид может быть безопаснее, чем использование ксенона, гексафторида серы, потому что не вызывает наркоз при некоторых концентрациях как и следовало ожидать с ксеноном.

[0040] В частности, газ клатрата вызывающие используется для выполнения изобретения должно быть в концентрации в смеси с выбранным в пределах около 75 молярных процентов до 95 моль. Поэтому кислород предпочтительно содержит остатки смеси и, следовательно, предпочтительно в концентрации 25 моль 5 моль, соответственно.

[0041] Например, биологическая ткань может изначально быть сброшены с газом клатрата вызывающие, который включает около 21 моль% кислорода и около 79% мол гексафторид серы. Таким образом, парциальное давление кислорода, налагаемых на образце клатратов газов вызывающих такое же, как парциальное давление кислорода в атмосфере Земли на уровне моря. Использование кислорода в газовой вызывающие клатратов в концентрации, что такое же или похожее на атмосферу Земли на уровне моря может помочь избежать возможного повреждения образца вызванных гипоксических окружающей среды.

[0042] В клатратных гидратов газа, молекулы газа заключены в клетку, как структура молекул воды со структурой, нечто вроде пятистороннего сот. Некоторые альтернативные имена для клатраты, в котором вода является хозяином видов водных клатратов, вода клатраты, и клатратных гидратов.

[0043] В клатратных гидратов газа, молекулы воды связаны между собой через водородные связи и создания кристаллической решетки (например, сотовый полости). Существует нет химической связи между молекулами воды, хозяин и закрытых молекулы газа. Примеры других известных клатрата формирование газов включают благородные газы аргон (Ar), криптон (Kr), азот (N), некоторые неполярные газы, некоторые haloalkanes, некоторые гидрофторуглеродов, трифторметана, fluoroform, R-23, ГФУ-23, bromotrifluoromethane, фреон FE-1301, тетрафторэтан, и R134a.

[0044] клатрата формирования газы, используемые в настоящем изобретении, гексафторид серы или ксенон. Применение ксенона и гексафторида серы в настоящее изобретение позволяет формирование газовых гидратов клатратов при умеренных давлениях и температурах, что является, вероятно, в результате их высокой молекулярной массы и силы достаточно сильны связанных ван-дер-ваальсовых. Для изобретения, эти газы были признаны нетоксичными в сочетании с кислородом. Кроме того, они желательны, потому что они были найдены быстро проникает в биологические ткани.

[0045] кислорода в смеси позволяет метаболической активности в hypothermically хранятся биологические ткани. Кислород также используется при приеме сохранились биологические ткани из гипотермии хранения, то есть восстановление биологической ткани, увеличивая его температуру до комнатной температуры с целью восстановления нормальной метаболической активности, т.е. жизненных функций.

[0046] Термин «жизнеспособным» средств, способных жить. Например, ткани hypothermically сохранились в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, могут быть отнесены к жизнеспособным. Хотя ткани в hypothermically сохранил государство, например, может проявлять мало обнаружить обмен веществ, ткань может быть восстановлена путем возвращения ее условия, например, при комнатной температуре, например, +20° С, при котором ткань обладает нормального обмена веществ.

[0047] Функция промывки шаг (110) для вытеснения газов в окружающей биологической ткани с газом, вызывающие клатратов. Биологической ткани предпочтительно иметь аппарат, пригодный чтобы выполнение шагов изобретения. Это, как правило, находится в контейнере какой-то представления замкнутого пространства и, таким образом, биологические ткани могут быть окружены атмосферных газов (воздуха) или могут быть окружены другими газами. Промывка шаг (100) очищает окружающую среду окружающих биологических тканях газов, помимо газа вызывающие клатратов.

[0048] фиг. 1 следующая показывает давления шаг (120), которая включает в себя давления на биологические ткани с газом, вызывающие клатратов на давление, которое образуют клатраты внутри клеток биологической ткани на желаемую температуру хранения в диапазоне от плюс одного градуса Цельсия в 0 плюс пять градусов Цельсия.

[0049] Этот шаг давления (120) лучше всего объясняется со ссылкой на фиг. 3, что график зависимости давления от температуры и который показывает давление и температурные условия, необходимые для клатратов газов вызывающих быть в клатратных формирования области (300), в лице заштрихованной области на фиг. 3. В этих условиях температуры и давления газа клатрата вызывающих форм клатратов с воды в биологических тканях. Фиг. 3 также иллюстрирует предпочтительный шагов процесса показаны пронумерованные стрелки для гипотермии сохранение и восстановление биологического ткани в соответствии с изобретением.

[0050], не заштрихованные области на графике показывает, где газ клатрата вызывающие присутствует в виде газа и воды присутствует в виде жидкости или твердом (лед). Например, при использовании гексафторида серы в качестве клатрат формирование газа, границы раздела фаз между серой фазы гидрат гексафторида клатратов и гексафторида серы газ-водяной смеси фазы границе заштрихованной области работает примерно по диагонали от левого нижнего в правый верхний. Как видно из этой границе раздела фаз, а при понижении температуры, давления, необходимого для осуществления фазового перехода из гексафторида серы газ-вода смесь серы клатрата гидрат гексафторида также уменьшается.

[0051] шаг давления (120) предпочтительно проводить изотермически и так изотермического давления показано стрелкой (301) при типичной температуре окружающей среды 20 градусов Цельсия. Давление, которое образуют клатраты внутри клеток биологической ткани на желаемую температуру хранения в диапазоне от плюс одного градуса по Цельсию до плюс пяти градусов по Цельсию на фиг. 3, между около 75 фунтов на квадратный дюйм калибра и 100 фунтов на квадратный дюйм залог. Это так же, как около 90 фунтов на квадратный дюйм абсолютного и 115 фунтов на квадратный дюйм абсолютного.

[0052] Это можно выполнить шаг давления (120), что концентрация газов вызывающих клатрата изменяется при увеличении давления на биологические ткани. Эта реализация не будет держать парциальное давление кислорода примерно постоянным, и это не является предпочтительным. Скорее, это предпочтительнее, что парциальное давление кислорода в газовой клатрата вызывающие что накладывается на биологические ткани остаются примерно постоянными, как давление, действующее на биологическую ткань увеличивается. Например, если газ клатрата вызывающие добавляется увеличить общее давление до 100 фунтов на квадратный дюйм колеи (115 фунтов на квадратный дюйм абсолютного), то парциальное давление гексафторида серы или ксенон в конце этого шага будет около 112 фунтов на квадратный дюйм абсолютного, а парциальное давление кислорода остается около 3 фунтов на квадратный дюйм абсолютного. Поддержание парциальное давление кислорода, налагаемые на образцы примерно постоянным на парциальное давление кислорода в атмосфере Земли на уровне моря, поможет избежать возможного повреждения биологической ткани, вызванное hyperoxic окружающей среды или кислородного отравления.

[0053] фиг. 1 следующая показывает охлаждения шаг (130), который находится в режиме охлаждения биологических тканей к желаемой температуры хранения. Охлаждение шаг (130) предпочтительно проводить изобарически, и так изобарических охлаждение показано стрелкой (302) на приблизительно максимальное давление около 100 фунтов на квадратный дюйм залог. Желаемой температуры примерно на один градус по Цельсию до плюс пять градусов Цельсия показан под стрелку (303).

[0054] скорость охлаждения биологических тканей может быть выбран и не ограничивается изобретение. Предпочтительно диапазоне скоростей охлаждения в диапазоне от +20° С до +50° С в течение продолжительностью от 15 минут до 120 минут. Выбор скорости охлаждения может зависеть от ряда факторов.

[0055] фиг. 1 также показаны дополнительные шаги, которые могут быть добавлены в описанных выше шагов.

[0056] дальнейшее охлаждение шаг (140) могут быть добавлены, который включает в себя охлаждения биологических тканей на второй желаемой температуры хранения теплее, чем о минус 20 градусов Цельсия, в котором второй желаемого температура хранения, на которой клатратов будут формироваться и остаются в ткани из газовой вызывающие клатратов на втором давление хранения от 15 фунтов на квадратный дюйм калибра и 100 фунтов на квадратный дюйм колеи. Это дальнейшее охлаждение шаг (140) лучше всего объясняется со ссылкой на фиг. 3. Клатрата формирования области (300) показано, как заштрихованной области примерно с левой стороны нулевой линии температуре представляет условиях температуры и давления, в которой биологические ткани могут быть приняты в соответствии с этим еще один шаг охлаждения (140). Дальнейшее охлаждение шаг (140) представлены стрелками (304), которая может быть выполнена с различной давления. Тем не менее, это дальнейшее охлаждение шаг (140) предпочтительно проводить изобарически (131). Как видно из фиг. 3, минимальная температура в соответствии с этим шагом около минус 20 градусов по Цельсию. Кроме того, со ссылкой на фиг. 1 и 3, если вторая давление хранения составляет около атмосферном давлении, то есть около 15 фунтов на квадратный дюйм колеи (151), то самым теплым, что второй желаемой температуры хранения совместимый с ограничениями на данном этапе может быть около минус 10 градусов по Цельсию.

[0057] При реализации дополнительного охлаждения еще один шаг (140), второй этап давления (150) не требуется, и что подвергает биологической ткани на второй давления хранения. Хотя можно установить вторую давление хранения примерно в то же значение, как желаемое давление хранения достигается при морозе выше, предполагается, что хранение при меньшем давлении, такие как атмосферное давление, было бы предпочтительнее в течение длительных периодов времени. Этот шаг представляется стрелкой (305) на фиг. 3.

[0058] Тем не менее, это второй шаг давления (150) сформулирована таким образом, чтобы требовать подчинения биологической ткани под давлением, а не о том, разгерметизация или давления шаг. Это позволит разместить ситуации, например, где давление выше нуля хранения составляет 80 фунтов на квадратный дюйм колеи и второе давление хранения составила 100 фунтов на квадратный дюйм колеи. Было бы также разместить ситуации, когда давление выше нуля хранения составила 100 фунтов на квадратный дюйм, а второй давление хранения составляет 80 фунтов на квадратный дюйм.

[0059] необязательно, но желательно, перед проведением дополнительной Следующим шагом охлаждения (140), температуры и давления, налагаемые на биологические ткани при первом охлаждении сохраняется примерно постоянным в течение времени (изотермических и изобарических условиях). Этот период времени является продолжительность над которыми большая часть клатрата структуры, которые могут образовываться в биологическую ткань формируется в биологических тканях. Например, этот период может быть выбран в качестве продолжительности, необходимой для 90% воды для включения в клатратных должны быть включены в клатратов. Этот период времени может быть выбран на основе теоретических и эмпирических моделей кинетики клатрата образование и или итерационным методом проб и ошибок проводится на опытных образцов одного и того же или аналогичный состав, что и биологические ткани, что является hypothermically быть сохранены. Например, такой период времени может быть выбран в пределах от 15 минут до 120 минут.

[0060] действий по восстановлению показано на фиг. 2. Это шаги, которые будут добавлены к гипотермии шагов сохранения для восстановления биологических тканей в жизнеспособном состоянии (200). Делается также ссылка на фиг. 3.

[0061] Самый простой метод восстановления для хранения гипотермии выше нуля (ноль градусов по Цельсию) является одним восстановления разгерметизации шаг (240) с участием разгерметизации биологической ткани в то время как потепление биологической ткани на давление и температуру, которая восстанавливает ткани жизнеспособного государства.

[0062] лучший способ для восстановления биологических тканей включает в себя восстановление промывки шаг (210), включающий промывку биологическую ткань смесью восстановления газа, состоящего из гелия и кислорода. Гелия в концентрации в смеси газов восстановление в пределах 90 мольных процентов до 95 мол. Кислородом в концентрации в смеси газов восстановление в пределах около 5 мол до 10 мол. Промывка вытесняет газ клатрата вызывающие окружающих биологических тканей с восстановлением смеси газа и проникает в биологические ткани, которая препятствует биологической ткани с резким клатрата распада в этап восстановления.

[0063] Для восстановления биологической ткани хранятся выше нуля (ноль градусов по Цельсию), промывку лучше происходит при давлении в диапазоне от 100 фунтов на квадратный дюйм абсолютного до 120 фунтов на квадратный дюйм абсолютного (240).

[0064] Для восстановления биологической ткани хранятся ниже точки замерзания, промывка предпочтительно происходит под давлением, что обеспечивает биологическую ткань в области формирования клатратов (300) определяется заштрихованной области на фазовой диаграмме фиг. 3. Таким образом, подвергая шаг (220) подвергает биологической ткани в газовой смеси на восстановление восстановления давления, что позволяет клатратов газов вызывающих формирование клатраты внутри клеток биологических тканей при температуре выше нуля градусов Цельсия.

[0065] В начале процесса восстановления биологической ткани содержит газовых гидратов из клатратов газов вызывающих. Таким образом, желательно, чтобы процесс восстановления выполняется в условиях температуры и давления, которые поддерживают газовых гидратов в процессе потепления выше температуры замерзания. Таким образом, формирование водяного льда на морозе ниже будет предотвращено. Таким образом, до потепления биологическую ткань, она должна подвергаться давлению, которое будет поддерживать биологическую ткань в области формирования клатратов (300) показано в заштрихованной области на фиг. 3.

[0066] В более холодных, чем замораживание хранения, биологическая ткань может храниться при температуре от минус 10 до минус 20 градусов по Цельсию и, следовательно, может быть в любое давление хранения примерно между атмосферным давлением и около 100 фунтов на квадратный дюйм колеи. Со ссылкой на фиг. 3, можно легко видеть, что для того, чтобы биологические ткани остаются в условиях температуры и давления в области формирования клатратов (300) во время процесса потепления выше нуля градусов по Цельсию температура, биологическая ткань должна быть подвергнута восстановления газовой смеси при давлении около 75 фунтов на квадратный дюйм калибровочных до 100 фунтов на квадратный дюйм колеи.

[0067] Например, если вторая давление хранения при атмосферном давлении, то биологическая ткань будет repressurized смесью добычи газа до давления в диапазоне от около 75 фунтов на квадратный дюйм калибровочных до 100 фунтов на квадратный дюйм колеи. Кроме того, если вторая давление хранения составляет 100 фунтов на квадратный дюйм датчик, то ткани могут быть подвергнуты смесь добычи газа при том же давлении, или в любое давление между около 75 фунтов на квадратный дюйм калибровочных до 100 фунтов на квадратный дюйм колеи. Это подвергает этап восстановления (220) могут быть выполнены изотермически и показано на фиг. 3, как стрелка (306).

[0068] После того, биологическая ткань подвергается восстановлению давления, первым шагом восстановления потепления (230) включает в себя нагревание биологической ткани в первом восстановления температуры выше нуля градусов Цельсия. Этот шаг может быть выполнен изобарически и показано на фиг. 3, как стрелка (307).

[0069] Предпочтительно, первый восстановления температуры составляет от примерно на один градус по Цельсию, и около пяти градусов по Цельсию, которая остается в клатратных формирование региона, но первый температура восстановления может быть в любой выше температуры замерзания, которая поддерживает жизнеспособную биологическую ткань. Фиг. 3 иллюстрирует случай, когда первая температура восстановления примерно на 5 градусов по Цельсию, когда предпочтительным разгерметизации шаг (240), указанном стрелкой (308) начинается.

[0070] Темпы потепления на первый восстановления температуры могут быть выбраны. Например, темпы потепления могут быть в диапазоне от 1° в час до 20° C. час. Например факторов, которые следует учитывать при выборе скорости потепления уровень теплопроводности через образец и / или размера выборки. Например, относительно высокие темпы потепления могут быть выбраны для образца, через которые тепло проводится быстро и или мало. Например, относительно низкие темпы потепления могут быть выбраны для образца, через которые тепло проводится медленно и или большой. Темпы потепления могут быть выбраны так, что температуры в биологической ткани является относительно постоянной. Потепление биологической ткани может быть достигнуто, например, путем проведения, например, за счет увеличения температуры газа, окружающего или циркулирующих об образце или повышении температуры стенки камеры давления, где процесс может быть осуществлен.

[0071] высокие темпы потепления образца при сохранении аналогичной температуры в образце может быть достигнуто путем радиационно нагрева образца или с использованием комбинированного излучения и проводимости для нагрева образца. Например, микроволновые печи могут использоваться для нагрева образца. Микроволны могут проникать в образец для производства тепла в глубь образца, а не только тепло, идущий от поверхности образца в интерьер как с нагревом проводимости от стенки камеры давления и окружающего газа. Так, например, инфракрасное излучение может быть использовано. Независимо от того излучения, отобранных для нагрева образца, тип излучения, например, микроволновую печь или инфракрасные и характеристики излучения, например, длина волны зависит от оценки ряда факторов, таких как прозрачность регионах, например, внешние слои, образца для излучения и поглощения регионов, например, внутренние области, образца на излучение.

[0072] предпочтительным разгерметизации шаг (240) включает в себя разгерметизации биологической ткани при нагревании биологической ткани на давление и температуру, которая восстанавливает ткани жизнеспособного государства.

[0073] Кроме того, процесс восстановления может согреть изобарически, а затем сбросить давление в атмосферных условиях в два этапа. Тем не менее, контроль давления в то время как потепление является ненужным усложнением процесса.

[0074] Скорость снижения давления и изменения температуры при понижении давления (если температура повышается при снижении давления) могут быть необязательно выбирается в зависимости от ряда факторов. Например, скорость снижения давления могут быть выбраны, чтобы газы, растворенные в образце мигрировать из образца без образования пузырьков или с образованием только мелкие пузырьки, с целью избежать образования пузырьков газа в размере , что может привести к повреждению образца. Если температура повышается в то время как давление уменьшается, изменение растворимости газов в тканях с повышенной температурой может быть рассмотрен. Изменение растворимости газов в тканях с повышенной температурой может также повлиять на выбор при изменении температуры при понижении давления. Выбор скорости снижения давления и или изменения температуры при понижении давления, могут руководствоваться теоретическими и эмпирическими моделями, например, дайвинг таблицы декомпрессии или методом проб и ошибок, экспериментов на пробные образцы.

[0075] После разгерметизации предпочтительным шагом (240), биологические ткани могут быть возвращены в окружающую среду газов в атмосфере.

[0076] Когда выше нуля гипотермии хранения используется, метод восстановления аналогично. Те же действия, как описано выше для хранения ниже нуля участвует, за исключением, нет необходимости для первого шага восстановления потепления (230), поскольку биологические ткани уже выше нуля. Таким образом, восстановление промывки шаг (210), подвергая этап восстановления (220), а также предпочтительный разгерметизации шаг (240) выполняется, когда выше нуля гипотермии хранения используется. Пример 1 Гипотермическое сохранение тканей с гидрата ксенона клатраты

[0077] Эксперименты проводились на 10 белых мышей (Mus мышцы), мужчина (6-8 недель; 25 ± 2 г массы тела). Животных усыпляют с Галотан (Sigma-Aldrich,. Cat # B4388) (в соответствии с процедурами, рекомендованных Группой об эвтаназии Американской Ветеринарной Ассоциации) и сердца немедленно расчленены и введен в CORNING.RTM. флаконах (без крышки), содержащий 200 III кислородом изменение Кребса Henselite решение (118,4 ммоль NaCl, 25 мл NaHCO 3, 4,7 мл KCl, 1,6 мл KH2PO.sub.4, 0,6 MgSO 4 мл, 2,5 мл CaCl2, 11 мл глюкозы) в защиты сердечной ткани от высыхания. Кардиомиоцитов служить моделью для изучения динамики повреждение митохондрий в клинической и экспериментальной патологии.

[0078] флаконы были введены в барокамере, под давлением с ксенон-кислородной смеси (90 фунтов на квадратный дюйм ксенон, 10 фунтов на квадратный дюйм кислорода) и оставили на льду в течение 15 минут. Контрольные образцы были под давлением азота-кислородной смеси (90 фунтов на квадратный дюйм азота, 10 фунтов на квадратный дюйм кислорода). Тогда давление камеры были помещены на стендах в контейнер из пенопласта над жидким азотом для постепенного охлаждения в течение 15 минут. Во время охлаждения под давлением камеры в жидком азоте пар, давление упало в связи с сокращением газа и незначительные утечки. Впоследствии барокамеры были погружены в жидкий азот в течение еще 15 минут.

[0079] барокамеры с целой мышиной сердца нагревают при комнатной температуре в течение 15 минут и открыто. Температура образцов измерялась с помощью Sper научно 800024 Multi-вход термопары термометры (кат. № К-9446I-35 от Cole-Parmer Instrument Company, Вернон Хиллс, штат Иллинойс) с гибкой TeflonR изолированные провода-щупа. Температура сердечной образцов -94 ± 2,5° C. сразу после открытия камеры.

[0080] жесткости сердечной ткани в камере, заполненной ксеноном-кислородной смеси под давлением было по-другому по сравнению с контрольными образцами сердечной, которые были прямо замораживали в жидком азоте. Сердечных образцы фирмы и легко резать лезвием, а не камня сложно, как в контрольном образце, который был прямо замораживали в жидком азоте при нормальном давлении.

[0081] Для исследования степени повреждения сердечной ткани после применения метода изобретения с участием холоднее, чем замораживание хранения (основано на использовании газа клатрата вызывающие ксенона и кислорода) и управления заморожены под давлением азота кислородной смеси, просвечивающей электронной микроскопии ткани сердца была выполнена.

[0082] образцы тканей сердца (3 3 3 мм³) Были отрезаны от вершины и сразу зафиксирован в холодной (+4° С) 2,5% глутарового альдегида в 0,1 М натрий буфер Соренсена (электронная микроскопия наук,. Cat # 15980) (сердечной пробы размораживают при комнатной температуре до 0° С до сдачи их в фиксатор, чтобы избежать фиксации артефактов). Образцы были после фиксированного 1% осмия в том же буфере в течение одного часа при комнатной температуре, а затем промывают три раза тем же буфером, и в три раза дистиллированной водой. Образцы были окрашены целиком с 0,5% уранилацетата течение двух часов при комнатной температуре, затем промывают три раза дистиллированной водой и постепенно обезвоженной с этанолом до перевода в ацетоне. Spurrs эпоксидной смолы были использованы для проникновения и блоки полимеризованного в течение 48 часов при температуре 60° C. Тонкие срезы разрезать на LEICA Ultracut R микротома и пост-окрашенных уранилацетатом и цитратом свинца. Образцы были обнаружены и зарегистрированы в 80 кВ ускоряющего напряжения на Philips CM-12 Сканирование просвечивающей электронной микроскопии (Нидерланды) в электронной микроскопии и WM Keck Bioimaging лаборатории Университета штата Аризона. Изображения были записаны на цифровой Gatan 791 прибор с зарядовой связью камеры (Gatan, Inc Warrendale, штат Пенсильвания).

[0083] Электронная микроскопия сердечной ткани показали очевидные и существенные различия в структурах митохондрий кардиомиоцитов "из различных протоколов криоконсервации. Существовал наличии необратимых повреждению клеточной мембраны (например, разрушение миофибрилл и цитоплазматических впячивания мембраны) из кардиомиоцитов, которые были прямо замораживали в жидком азоте при нормальном давлении. Кроме того, была снижена плотность митохондрий в кардиомиоцитах криоконсервации с высоким давлением азотно-кислородной газовой смеси и охлаждается в жидком азоте. С другой стороны, сравнительно хорошо сохранившихся митохондрии находились в кардиомиоциты сердечной образцов после методом изобретения.

[0084] Сравнительный анализ структурных изменений в митохондриях показали сильное снижение плотности митохондрий в сердечных образцов, которые были прямо замораживали в жидком азоте, по сравнению с обработанными сердечной образцов. Денситометрии митохондриальной матрицы осуществляется с помощью программного обеспечения lmagej (NIH, http://rsb.info.nih.gov/ij/). Плотность митохондриях в митохондриях нормализовалась против рибосомы шероховатой эндоплазматической сети. Статистический анализ был проведен по Стьюдента испытаний; значения среднее ± стандартное отклонение (SD). Р-значение менее 0,05 считали статистически значимыми. Плотность митохондрий в сердечных образцы hypothermically сохранились использованием газа клатрата вызывающие ксенона и кислорода был значительно выше (почти как в неповрежденной ткани сердца), чем в митохондриях кардиомиоцитов в образцах, которые были заморожены в сжатого азота-кислородная смесь . Р-значение менее 0,05 указанных статистически значимой разницы между плотностью наблюдается в образцах hypothermically сохранились использованием газа клатрата вызывающие ксенона и кислорода в соответствии с изобретением, по сравнению с образцами, замороженные в сжатого азота-кислородная смесь. Примерно 76% из митохондрий сердечной образцы, которые прошли гипотермии процесс сохранения изобретения была та же плотность, что и ссылка сердечной образцов. Структура эндотелиальных клеток капилляров относительно хорошо сохранились после применения метода изобретения с участием ниже нуля хранения.

[0085] Нет набуханию митохондрий, разрыв внутренней и внешней мембраны или утечку митохондрий в цитоплазму наблюдалось в образцах тканей, которые прошли гипотермии сохранение в соответствии с процессом изобретения. В контрольной сердечной образцов (после замораживания прямо под высоким давлением в азотно-кислородной смеси в 100 фунтов на квадратный дюйм), электронная микроскопия показала фрагментация внутренней мембране митохондрий, разрыв внутренних и внешних оболочек, и утечки митохондрий в цитоплазму .

[0086] Электронная микроскопия показала, диффузный эндотелиальных клеток и повреждения отмечены периваскулярные отеки место в сердечной образцов после прямой замораживание в жидком азоте при нормальном давлении. Обширные капиллярной ущерб в сердечной мышце после инкубации при высоких давлении азотно-кислородной газовой смеси и охлаждения в жидком азоте, а также. С другой стороны, структура эндотелиальных клеток капилляров относительно хорошо сохранившиеся после выполнения гипотермии процесс сохранения изобретения.

[0087] Гипотермическое сохранение тканей ксенон-кислородной гидрат клатратов могут защитить ткани, удержание воды в клетках образование клатратов воды с внесенными газов, что ограничивает образование льда за пределами клетки. Ксеноновые форм клатратов выше 0° С при относительно низком давлении.

[0088] Ксенон имеет высокую проницаемость кожи. Использование ксенона под высоким давлением (который с высокой проницаемостью), может предотвратить клетки от замерзания повреждений, вызванных внутриклеточными обезвоживания. Использование высокого давления ксенон-кислородной смеси, в соответствии с изобретением, в результате отсутствия следующие повреждения клеток: набуханию митохондрий, разрыв внутренних и внешних оболочек, и, утечки митохондрий в цитоплазму. В отличие от замерзания под высоким давлением азота выставлены такие повреждения клеток. Другие показали, что потеря митохондриальных мембранного потенциала приводит к набуханию митохондрий, и это хорошо известно, что постоянный ишемия приводит к потере матрицы плотности, а это связано с набуханию митохондрий.

[0089] Еще один важный признак тяжелого повреждения клеток является инвагинации цитоплазматической мембраны. Это было воспринято в нашем контроль сердечной образцов после прямой замораживание в жидком азоте. Этот факт указывает на морфологические повреждения мембран.

[0090] Митохондриальная гомеостаза объем хозяйство функции, которые необходимы для поддержания структурной целостности органелл. Митохондриальная отек также является одним из ключевых игроков в цитохром с выпуска связано с апоптоз клеток. Измерение концентрации кардиолипину может быть сделано, чтобы оценить повреждение митохондрий. В неповрежденных клеток, клеточного распределения кардиолипину ограничен митохондрий. Обнаружение кардиолипину вне митохондрий является признаком тяжелого повреждения митохондриальной мембраны. Межклеточной замораживание может вызвать повреждение клеток в процессе оттаивания, во время которого перекристаллизации может произойти. В отличие от ксенона газовых гидратов клатраты образуются в соответствии с изобретением легко ломаются, как перепады давления, без внутриклеточной воды повторной кристаллизации. Пример 2 Восстановленные биологических тканей Наличие Biopreservation Маркера

[0091] В варианте восстановления биологических образцов тканей, ранее hypothermically сохранились при температуре от -10° С до -20° С, имеет температуру не менее +50° С и экспонаты метаболизма. Восстановления биологической ткани предпочтительно biopreservation маркер в измеряемых количествах. Измеряемых количеством biopreservation маркер может отличаться от количества в биологической ткани выставке метаболизм до гипотермии сохранения. Например, biopreservation маркер может быть кардиолипину или лактатдегидрогеназы. Пример 3 Восстановление тканей Hypothermically Сохранилось без рекомпрессии

[0092] растворимость характеристики клатрата формирования газ, используемый в hypothermically сохранения тканей могут влиять на количество газа, растворенного в пробе. Так, например, гексафторид серы имеет более низкую растворимость в биологической ткани, чем ксенон. Когда ткань hypothermically сохранились с ксеноновой нагревается без промывки и repressurization с газом, таким как гелий-кислородной смеси, пузырьки газа ксенона может образовывать в тканях и может привести к повреждению тканей.

[0093] В отличие от этого, из-за более низкой растворимости в биологических тканях гексафторид серы, ткань hypothermically сохранились с гексафторида серы может быть нагрета без промывки и repressurization без образования пузырьков гексафторида серы в тканях для более широкого круга условий hypothermically сохранились ткани (например, диапазон температур от гипотермии сохранения и или давлением клатратных формирования газ, наложенные на ткани при сохранении гипотермия). Пример 4 Формирование гидрата ксенона клатраты в Животные [0094] Испытания проводились, в котором газовая смесь ксенона в том числе (около 90 моль%), азота (около 8 моль%) и кислорода (О 2 моль%) при общем давлении около 50 фунтов на квадратный дюйм был навязан планарии живут организмы, при температуре +50° C. ксеноновые клатрата образование в тканях планарий наблюдается. Высокого давления контейнер, в котором планарии были проведены включены стекла, как наблюдение порт. Через наблюдение порта, изменение цвета ткани планарии на хлопок, как внешний вид свидетельствует о формировании гидрата клатрата ксенон, внешний вид отличался от замороженной ткани, в которых внутриклеточный лед образуется. Кроме того, наблюдаемое прекращение движения планарии организмов было связано с образованием гидрата клатрата ксенона в ткани.

[0095] После того, как давление было выпущено и планарии были возвращены в воздухе при атмосферном давлении, гидрата ксенона клатрата наблюдается в тканях планарий наблюдается в рассеялись, изменение цвета ткани планарии не наблюдалось. Кроме того, после того, как давление было выпущено и планарии были возвращены в воздухе при атмосферном давлении, планарии наблюдались с их движением, чтобы быть живым и прожил около 24 часов. Это свидетельствует о том, что порядок формирования ксенон клатратных гидратов в планарии носит обратимый характер, и что планарии hypothermically сохранились за счет образования гидратов ксенон клатрата были жизнеспособными. Пример 5 Формирование серы гидрат гексафторида клатраты в Животные

[0096] Испытания проводились, в котором газовая смесь гексафторида серы при парциальном давлении 90 фунтов на квадратный дюйм и кислород при парциальном давлении 10 фунтов на квадратный дюйм (в общей сложности давлении 100 фунтов на квадратный дюйм), был введен на живые организмы планарии. Планарии организмов в соответствии с газовой смесью охлаждают на льду при температуре около 0° С. Сера образование клатратов гексафторида в тканях планарий наблюдается. Высокого давления контейнер, в котором планарии были проведены включены стекла, как наблюдение порт. Через наблюдение порта, изменение цвета ткани планарии на хлопок, как внешний вид свидетельствует о формировании серы гидрата клатрата гексафторида вид отличался от замороженной ткани, в которых внутриклеточный лед образуется. Кроме того, наблюдаемое прекращение движения планарии организмов было связано с образованием серы гидрат гексафторида клатратов в ткани.

[0097] После того, как давление было выпущено и планарии были возвращены в воздухе при атмосферном давлении, серы гексафторид клатратов, которые наблюдаются в тканях планарий наблюдается в рассеялись, изменение цвета ткани планарии не наблюдалось. Кроме того, после того, как давление было выпущено и планарии были возвращены в воздухе при атмосферном давлении, планарии наблюдались с их движением, чтобы быть живым и прожил около 24 часов. Это свидетельствует о том, что порядок формирования гексафторида серы клатратов в планарии носит обратимый характер, и что планарии hypothermically сохранились за счет образования гидратов серы гексафторид клатрата были жизнеспособными. Пример 6 Гипотермическое Сохранение животных с гексафторид серы или ксеноновые гидратов клатраты и восстановление

[0098] клатрата формирования газ, например, гексафторид серы и / или ксенона, могут быть использованы для обратимо hypothermically сохранения организмов и животных. Например, газ клатрата вызывающие под давлением, например, смесь гексафторида серы на парциальное давление около 90 фунтов на квадратный дюйм и кислород при парциальном давлении около 10 фунтов на квадратный дюйм (в общей сложности давлении 100 фунтов на квадратный дюйм) или смесь ксенона на парциальное давление около 90 фунтов на квадратный дюйм и кислород при парциальном давлении около 10 фунтов на квадратный дюйм (в общей сложности давлении 100 фунтов на квадратный дюйм), могут быть наложены на организма, таких как животные, например, планарии, в камере высокого давления. Камера высокого давления с организмом, например, планарии, может быть охлаждена на льду в течение около 1 часа, скажем, до температуры приближении к 0° C. Камера высокого давления с организмом, например, планарии, может быть охлажден при температуре около -20° С, давление клатратов газов вызывающих может быть освобожден, и организм, например, планарии, в камере высокого давления могут подвергаться воздействию воздуха в атмосфере. Камера высокого давления с организмом, например, планарии, могут быть сохранены как hypothermically сохранились при температуре -20° С в течение длительного периода времени, например, одну неделю.

[0099] hypothermically сохранились организма, например, планарии, могут быть восстановлены, например, следующим образом. Камера высокого давления с организмом, например, планарии, могут быть сброшены со смесью инертных газов и кислорода, например, гелием при парциальном давлении около 90 фунтов на квадратный дюйм и кислород при парциальном давлении около 10 фунтов на квадратный дюйм, чтобы удалить клатрата формирование газа, например, гексафторид серы и или ксенон, из биологических тканей животного. Температура камеры высокого давления с организмом, например, планарии, может быть постепенно увеличена с течением времени, например, при комнатной температуре, например, около +20° С. Когда температура повышается, давление может быть постепенно снизилась. Такая промывка с последующим постепенным потеплением и разгерметизации могут быть использованы, чтобы избежать образования пузырьков газа в организме, которые могут быть вредными для ткани. Организм, например, планарии, могут быть удалены из камеры и на воздухе при атмосферном давлении и комнатной температуре. Состояние организма, например, его жизненные функции, могут быть исследованы. Пример 7 Гипотермическое сохранение органов животных с гексафторид серы или ксеноновые гидратов клатраты и восстановление

[0100] клатрата формирования газ, например, гексафторид серы и / или ксенона, могут быть использованы для обратимо hypothermically сохранить все органы и части органов от животных. Например, газ клатрата вызывающие под давлением, например, смесь гексафторида серы на парциальное давление около 90 фунтов на квадратный дюйм и кислород при парциальном давлении около 10 фунтов на квадратный дюйм (в общей сложности давлении 100 фунтов на квадратный дюйм) или смесь ксенона на парциальное давление около 90 фунтов на квадратный дюйм и кислород при парциальном давлении около 10 фунтов на квадратный дюйм (в общей сложности давлении 100 фунтов на квадратный дюйм), могут быть наложены на орган, таких как сердце, почки или печень. Камера высокого давления с органом может быть охлаждена на льду в течение около 1 часа, скажем, до температуры приближении к 0 ° C. Камера высокого давления с органом могут быть охлаждены до температуры около -20 ° C. , давление клатратов газов вызывающих может быть освобожден, и организм, например, планарии, в камере высокого давления могут подвергаться воздействию воздуха в атмосфере. Время для охлаждения органа и снятия давления могут быть изменены, в зависимости, например, от размера органа. Например, маленький образец орган, например, некоторые клетки, может потребоваться менее чем за 24 часов. Например, весь внутренний орган, например, сердца, почек или печени, может потребоваться до 48 часов или 72 часа.

Вас категорически не устраивает перспектива безвозвратно исчезнуть из этого мира? Вы не желаете закончить свой жизненный путь в виде омерзительной гниющей органической массы пожираемой копошащимися в ней могильными червями? Вы желаете вернувшись в молодость прожить ещё одну жизнь? Начать всё заново? Исправить совершённые ошибки? Осуществить несбывшиеся мечты? Перейдите по ссылке: «главная страница».

A method for hypothermic preservation of biological tissue for later recovery to a viable state includes flushing the biological tissue with a gas mixture of sulfur hexafluoride or xenon and oxygen. The sulfur hexafluoride or xenon is in a concentration in the mixture between about 75 mole percent to 95 mole percent. The method includes pressurizing the biological tissue, preferably isothermically, with the mixture to a pressure that will form clathrates inside the biological tissue at a desired storage temperature in a range of about +1° C. to about +5° C. The method includes a step of cooling the biological tissue, preferably isobarically, to the desired storage temperature. Optional steps for further cooling to no colder than about ?20° C. and for depressurization are provided as well as steps for recovering the hypothermically preserved biological tissue to a viable state, preferably using a recovery gas mixture.

Claims

1. A method for hypothermic preservation of biological tissue for later recovery to a viable state, comprising the steps of:flushing the biological tissue with a clathrate inducing gas consisting of a mixture of a clathrate forming gas and oxygen;wherein the clathrate forming gas is selected from the group consisting of:sulfur hexafluoride; and, xenon;wherein the clathrate forming gas is in a concentration in the mixture selected from within a range of about 75 mole percent to 95 mole percent;and,wherein flushing displaces gases surrounding the biological tissue with the clathrate inducing gas;pressurizing the biological tissue with the clathrate inducing gas to a pressure that will form clathrates inside the biological tissue at a desired storage temperature in a range of about plus one degree Centigrade to about plus 5 degrees Centigrade; and,cooling the biological tissue to the desired storage temperature.

2. The method of claim 1 further comprising the steps of:cooling the biological tissue to a second desired storage temperature warmer than about minus 20 degrees Centigrade, wherein the second desired storage temperature is one at which clathrates would form and remain in the tissue from the clathrate inducing gas at a second storage pressure between about 15 pounds per square inch gauge and 100 pounds per square inch gauge; and,subjecting the biological tissue to the second storage pressure.

3. The method of claim 2 wherein the second storage pressure is approximately 15 pounds per square inch gauge.

4. A method for recovery to a viable state of biological tissue hypothermically preserved according to claim 2, the method for recovery comprising the steps of:flushing the biological tissue with a recovery gas mixture consisting of:helium in a concentration in the recovery gas mixture within a range of 90 mol percent to 95 mole percent; and,oxygen in a concentration in the recovery gas mixture within a range of about 5 mole percent to 10 mole percent;wherein flushing displaces the clathrate inducing gas surrounding the biological tissue with recovery gas mixture;subjecting the biological tissue to the recovery gas at a recovery pressure that permits the clathrate inducing gas to form clathrates inside the biological tissue at temperature above zero degrees Centigrade;warming the biological tissue to a first recovery temperature above zero degrees Centigrade;depressurizing the biological tissue while warming the biological tissue to a pressure and temperature that restores the biological tissue to a viable state.

5. The method of claim 1 wherein the pressure is in a range of about 75 pounds per square inch gauge to about 100 pounds per square inch gauge.

6. The method of claim 1, wherein the step of pressurizing the biological tissue is performed approximately isothermally.

7. The method of claim 1, wherein the step of cooling the biological tissue sample is performed approximately isobarically.

8. A method for recovery to a viable state of biological tissue hypothermically preserved according to claim 1, the method for recovery comprising the steps of:flushing the biological tissue with a recovery gas mixture consisting of:helium in a concentration in the mixture within a range of 90 mole percent to 95 mole percent; and,oxygen in a concentration in the mixture within a range of about 5 mole percent to 10 mole percent;wherein flushing takes place at a pressure within a range of 100 pounds per square inch absolute to 120 pounds per square inch absolute; and,depressurizing the biological tissue while warming the biological tissue to a pressure and temperature that restores the tissue to a viable state.

9. A method for recovery to a viable state of biological tissue hypothermically preserved according to claim 1 using sulfur hexafluoride as the clathrate-forming gas, the method for recovery comprising the step of depressurizing the biological tissue while warming the biological tissue to a pressure and temperature that restores the tissue to a viable state; wherein the rate of warming is sufficient to preclude formation of sulfur hexafluoride bubbles in the biological tissue.

Description

CROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0001]This application claims the benefit of U.S. Provisional Application 61/071,730, filed May 14, 2008, which is hereby incorporated by reference herein.

TECHNICAL FIELD

[0002]The present invention encompasses a method of hypothermic preservation of biological tissue in a viable state in a controlled process of refrigeration in the presence of a chemical agent that minimizes cellular damage from refrigeration.

BACKGROUND ART

[0003]Biological tissue, or simply tissue, as used herein includes a plurality of cells or any cellular material that carry out a biological function. Any plant or animal tissue is included. Animal organs or whole animals, such as Planaria, are included. The cells are not necessarily identical, but are preferably of the same origin.

[0004]The primary storage mechanism employed in this invention uses tissue storage temperatures above zero degrees Centigrade, (i.e., above the freezing point of water at atmospheric pressure) in the presence of a gaseous chemical agent. The tissue remains viable in long or short term storage, essentially hibernating with significantly reduced biological function. The process enables the tissue to be later recovered to a viable state, that is, to a state with normal biological function.

[0005]The present invention can also be employed for biological tissue storage in a specific range of below freezing temperatures using this same gaseous chemical agent. These embodiments also maintain a viable tissue that is capable of restoration of normal tissue function when recovered to above freezing temperatures.

[0006]Conventional processes that seek to preserve tissue at low temperatures include near-freezing storage; conventional vitrification, and conventional cryopreservation. None teaches the process of the present invention and all suffer from overall inadequate performance in viable storage and recovery to a state of normal function.

[0007]Lowering the temperature as a preservative of biological tissue is known in the art. See for example U.S. Pat. No. 5,791,151 which uses a near-freezing temperature in an oxygen environment. However, sustaining viability of tissue and recovering the tissue to normal function with the teachings in the prior art is problematic.

[0008]Prior art processes typically use liquid polar organic compounds in solution to perfuse the biological tissue. These conventional processes are not reversible in that they cannot be used to restore tissue to life, although occasional exceptions are observed in nature that involve, for example, vitrifying polyols (i.e., insects, amphibians) or thermal hysteresis proteins (insects, fish). See, Fletcher G L, Hew C L and Davies P L, Antifreeze proteins of teleost fishes. Annu Rev Physiol, 63 (2001) 359-590; Graham L A, Liou Y C, Walker V K and Davies P L, Hyperactive antifreeze protein from beetles. Nature, 388 (1997) 727-728. The present method does not employ a liquid, but rather employs a specific gaseous chemical agent in a specific process that enhances the viability of biological tissue in short and long-term storage and enhances recovery of that tissue when required.

[0009]Near-freezing storage seeks to preserve organs by lowering their temperature near to the freezing point of water. See, e.g., U.S. Pat. No. 7,029,839. Near-freezing storage involves perfusing the tissue with an aqueous solution containing protectants that depress the freezing point of the solution, so that the tissue may be stored at low temperature with aqueous fluids in the cells in a liquid state. Examples of liquid polar organic compounds used as conventional protectants are dimethyl sulfoxide, glygerol, ethylene glycol, and propylene glycol. Conventional protectants can function by binding water through a combination of hydrophilic and hydrophobic interactions at different points on the molecule.

[0010]Conventional protectants can present problems when used on larger pieces of tissue; such problems are generally attributed to the nonuniform distribution of the protectants within the tissue. Conventional protectants typically diffuse slowly and pass through cell membranes and the blood-brain barrier poorly or not at all. Furthermore, large quantities of protectants may be required.

[0011]Typically, conventional protectants bind with about two moles of water per mole of protectant. When used in the required quantities to bind water conventional protectants may be toxic to cells. The near-freezing storage process is slow and requires that high concentrations of potentially harmful protectant chemicals be introduced to and removed from the tissue.

[0012]In general, preserving biological tissue by lowering its temperature below freezing is destructive of cellular tissue when crystalline ice forms within the cells (intracellular) and around cells (extracellular) as the liquid water within the biological tissue transitions to the solid phase (ice). The mechanism of freezing damage in living tissue is principally due to two processes.

[0013]The first process causing freezing damage involves the formation of ice in the intercellular spaces. The vapor pressure of the ice is lower than the vapor pressure of the solute water in the surrounding cells and as heat is removed at the freezing point of the solutions, the ice crystals grow between the cells, extracting water from them. As the ice crystals grow, the volume of the cells shrinks, and the cells are crushed between the ice crystals.

[0014]The second process causing freezing damage involves the concentration of solutes inside the water remaining in the cells as the cells shrink. The increased concentration of solutes increases the intracellular ionic strength and interferes with the organization of proteins and other intercellular structures. Eventually, the solute concentration inside the cells reaches the eutectic and freezes. The final state of the frozen tissue is pure ice in the extracellular spaces, and a mixture of concentrated cellular components in ice and bound water inside the cells.

[0015]Most lesions in tissue occur during re-warming and reperfusion of cryopreserved biological tissues, such as organs; the process of its development is time-consuming. Changes include condensation of chromatin, large lipid droplets, and partly disrupted plasma membrane; these changes may be seen on electron microscopy (which may be a consequence of the osmotic excursions incurred during a freeze-thaw cycle; leakage of mitochondrial matrix can trigger apoptosis as well).

[0016]Damage to biological tissue by freezing is caused, besides temperature stress owing to decrease in temperature itself, by the following processes: irreversible change of biological membrane by dehydration from the cells and surface of the membranes caused by the freezing process; destruction by loss in selective permeability; and, physical deformation and death of the cell. Light microscopy does not show early freezing damage to the cells. The present invention avoids such damage.

[0017]Conventional vitrification involves the use of a conventional cryoprotectant solution and cryogenic temperatures. See, e.g., U.S. Pat. No. 4,559,298. A concentrated aqueous cryoprotectant solution can permit solidification without the formation of ice crystals. That is, vitrification can involve inducing the transition of an aqueous liquid to an amorphous solid phase in both the intracellular and the extracellular spaces of tissue by cooling to a cryogenic temperature with the use of a conventional cryoprotectant, such as glycerol. However, vitrification requires the impregnation of biological tissues with high concentrations of toxic cryoprotective chemicals that promote the vitreous state.

[0018]Although vitrification can avoid ice formation, alternative potential mechanisms of injury associated with the amorphous state have been identified. Devitrification (ice formation in biological tissues during re-warming) is a major obstacle to successful organ vitrification and subsequent recovery. Vitrification has failed to successfully preserve and return to a viable state mammalian internal organs.

[0019]Conventional cryopreservation can involve the use of liquid cryoprotectant solutions to prevent intracellular ice crystal formation, while allowing ice crystals to form in extracellular areas. In addition to using potentially toxic protectant chemicals, conventional vitrification and conventional cryopreservation techniques can cause cells to undergo volume changes during vitrification or freezing, which results in mechanical stresses sufficient to cause cracking and cell destruction.

[0020]The use of xenon in cryopreservation was discussed by P. V. Shcherbakov and V.1. Telpuhov. See, P.V. Shcherbakov and V.1. Telpuhov, Chemistry and Life, v.8 (2006) pp. 34-39 (in Russian). Additionally, Russian patent RU2268590 to Shcherbakov, et al. (published Jan. 27, 2006 with English language Abstract) discusses saturating tissue with a mixture of xenon, krypton, and argon, forcing water out of the tissue with this mixture of noble gases under pressure while cooling to -43° C., and decreasing the pressure to ambient pressure and continuing to cool to -196° C. The present invention does not employ cryopreservation temperatures as taught by Shcherbakov. The pressure of the noble gas mixture presented in the Shcherbakov publications does not allow for sufficient water to be bound in the cells to allow for rehydration sufficient for metabolism to restart. The present invention utilizes a specific gas mixture and a specific concentration not taught in the Shcherbakov publications. Further, the Shcherbakov publications do not present a method suitable for viably storing tissue capable of recovery to a viable state as enabled in the present invention.

SUMMARY OF THE INVENTION

[0021]A method for hypothermic preservation of biological tissue for later recovery to a viable state is described. The method involves a step of flushing the biological tissue to displace the gases in the environment surrounding the biological tissue. The flushing gas is a gas mixture of sulfur hexafluoride or xenon and oxygen. The sulfur hexafluoride or xenon is in a concentration in the mixture in a range of about 75 mole percent to 95 mole percent. The method includes a step of pressurizing the biological tissue with the gas mixture to a pressure that will form clathrates inside the biological tissue at a desired storage temperature in a range of about plus one degree Centigrade to about plus 5 degrees Centigrade. This pressure is in a range from about 75 to 100 psig (121) and is preferably attained while maintaining the biological tissue at approximately the same temperature, that is, isothermically (122). The method includes a step of cooling the biological tissue to the desired storage temperature and is preferably cooled while maintaining the biological tissue at approximately a constant pressure, that is, isobarically.

[0022]Optional steps may be employed of further cooling the biological tissue to a second desired storage temperature warmer than about minus 20 degrees Centigrade and then depressurize the biological tissue. The second desired storage temperature is one at which clathrates would form and remain in the tissue from the clathrate inducing gas at a second storage pressure between about 15 pounds per square inch gauge, and 100 pounds per square inch gauge. Depressurization is preferably to atmospheric pressure of about 15 pounds per square inch gauge (151).

[0023]The invention optionally includes two further steps for recovering the biological tissue from the hypothermically preserved state. One such step includes flushing the biological tissue to remove the gas mixture. Flushing is performed with a recovery gas mixture of a first component selected from a group consisting of helium, a noble gas, nitrogen, and a combination of these; and, oxygen. The first component is at a partial pressure of about 90 pounds per square inch in the mixture. A second such step includes warming the biological tissue to a recovery temperature that restores the tissue to a viable state.

ADVANTAGEOUS EFFECTS OF THE INVENTION

[0024]Hypothermic preservation according to the present invention preserves the biological tissue in a viable state and enables reheating the biological tissue to restore the function of the tissue under its normal functioning temperature and pressure.

[0025]Hypothermic preservation according to the present invention is simple compared with less functional methods that require the use of a cryopreservation solution.

[0026]Hypothermic preservation according to the present invention is inexpensive in comparison with less functional conventional vitrification processes which use expensive chemicals like synthetic ice blocking compounds.

[0027]Hypothermic preservation according to the present invention is not toxic for biological specimens, in contrast with conventional cryopreservation and vitrification processes.

[0028]Hypothermic preservation of biological tissues according to the present invention may be used to preserve biological samples for which no conventional method of long-term preservation exists, such as human blood components for transfusion, such as human blood platelets, and human organs for transplantation, such as hearts, kidneys, and livers. Other applications of hypothermic preservation of biological tissue include the high-quality preservation of food, such as seafood.

BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0029]The drawings show preferred embodiments of the invention.

[0030]FIG. 1 illustrates preferred embodiments of the process of hypothermic preservation of biological tissue in accordance with the invention.

[0031]FIG. 2 illustrates preferred embodiments of the process of recovery of biological tissue hypothermically preserved in accordance with the invention.

[0032]FIG. 3 presents a graph of pressure versus temperature that illustrates process steps for hypothermic preservation and recover of a biological tissue according to the invention.

DESCRIPTION OF EMBODIMENTS

[0033]Embodiments of the invention are discussed in detail below. In describing embodiments, specific terminology is employed for the sake of clarity. However, the invention is not intended to be limited to the specific terminology so selected. A person skilled in the relevant art will recognize that other equivalent parts may be employed and other methods developed without parting from the spirit and scope of the invention.

[0034]The present invention encompasses a method for short- and long-term hypothermic preservation of biological tissues and cells that employ a gas mixture that sequesters some water in cells in a gas hydrate clathrate as cells are cooled, making the water unavailable to form ice crystals in the extracellular space.

[0035]FIG. 1 illustrates preferred embodiments of the process of hypothermic preservation of biological tissue in accordance with the invention. The solid connecting lines connect necessary steps and the dashed connecting lines connect optional steps.

[0036]The box designated (100) explains that the invention is a process or method for hypothermic preservation of biological tissue for later recovery to a viable state. The invention includes a plurality of steps, which, when the context permits, may be performed in any order.

[0037]A flushing step (110) includes flushing the biological tissue with a clathrate inducing gas consisting of a mixture of a clathrate forming gas and oxygen. The clathrate forming gas is either sulfur hexafluoride or xenon. The clathrate forming gas is in a concentration in the mixture between about 75 mole percent to 95 mole percent. The flushing displaces gases surrounding the biological tissue with the clathrate inducing gas.

[0038]Herein, the term "clathrate forming gas includes xenon or sulfur hexafluoride. It is these two specific gases that have been tested and provide the desired result of forming a gas hydrate clathrate under the conditions designated for the invention.

[0039]The term "clathrate inducing gas" includes a mixture of either of the two clathrate forming gases (xenon or sulfur hexafluoride) and oxygen. Thus, "clathrate inducing gas" includes a mixture of xenon and oxygen or a mixture of sulfur hexafluoride and oxygen. Sulfur hexafluoride may have advantages over xenon as the clathrate-forming gas. For example, sulfur hexafluoride is less expensive than xenon. This may allow for hypothermic preservation of biological tissue using sulfur hexafluoride on a larger scale than is practical for hypothermic preservation using xenon. Sulfur hexafluoride may be safer to use than xenon, because sulfur hexafluoride does not induce narcosis at some concentrations as might be expected with xenon.

[0040]More specifically, the clathrate inducing gas used to perform the invention must be in a concentration in the mixture selected from within a range of about 75 mole percent to 95 mole percent. The oxygen therefore preferably comprises the remainder of the mixture and is therefore preferably in a concentration of 25 mole percent to 5 mole percent, respectively.

[0041]For example, the biological tissue may initially be flushed with a clathrate inducing gas that includes about 21 mol % oxygen and about 79 mol % sulfur hexafluoride. In this way, the partial pressure of oxygen imposed on the sample by the clathrate inducing gas is the same as the partial pressure of oxygen in the Earth's atmosphere at sea level. Using oxygen in the clathrate inducing gas at a concentration that is the same or similar to that of Earth's atmosphere at sea level may help avoid potential damage to the sample caused by a hypoxic environment.

[0042]In a gas hydrate clathrate, a molecule of gas is enclosed by a cage-like structure of water molecules having a structure somewhat like a five-sided honeycomb. Some alternative names for clathrates in which water is the host species are aqueous clathrates, water clathrates, and clathrate hydrates.

[0043]In a gas hydrate clathrate, the water molecules are linked through hydrogen bonding and create a host lattice (i.e. the honeycomb cavities). There is no chemical bonding between the host water molecules and the enclosed molecule of gas. Examples of other known clathrate forming gases include the noble gases argon (Ar), krypton (Kr), nitrogen (N), some non-polar gases, some haloalkanes, some hydrofluorocarbons, trifluoromethane, fluoroform, R-23, HFC-23, bromotrifluoromethane, Freon FE 1301, tetrafluoroethane, and R134a.

[0044]The clathrate forming gases used in the present invention are sulfur hexafluoride or xenon. The use of xenon or sulfur hexafluoride in the present invention enables the formation of gas hydrate clathrates at moderate pressures and temperatures, which is a probably a result of their high molecular weight and rather strong associated van der Waal's forces. For the present invention, these gases have been found to be non-toxic when combined with oxygen. They are also desirable because they have been found to rapidly penetrate into biological tissue.

[0045]The oxygen in the mixture permits metabolic activity in hypothermically stored biological tissue. Oxygen is also useful when taking preserved biological tissue out of hypothermic storage, i.e., recovering biological tissue by increasing its temperature to room temperature with the intention of restoring normal metabolic activity, i.e., life functions.

[0046]The term "viable" means capable of living. For example, tissue hypothermically preserved according to an embodiment of the present invention may be referred to as viable. Although the tissue in its hypothermically preserved state, for example may exhibit little detectable metabolism, the tissue may be recovered by returning it to conditions, for example, room temperature, e.g., +20° C., at which the tissue exhibits normal metabolism.

[0047]The function of the flushing step (110) is to displace gases in the environment surrounding the biological tissue with the clathrate inducing gas. The biological tissue will preferably be in an apparatus suitable to enable performance of the steps of the invention. This will typically be in a container of some kind presenting a closed environment and, thus, the biological tissue may be surrounded by atmospheric gases (air) or may be surrounded by other gases. The flushing step (100) clears the environment surrounding the biological tissue of gases other than the clathrate inducing gas.

[0048]FIG. 1 next shows a pressurizing step (120), which includes pressurizing the biological tissue with the clathrate inducing gas to a pressure that will form clathrates inside the cells of the biological tissue at a desired storage temperature in a range of about plus one degree Centigrade to about plus five degrees Centigrade.

[0049]This pressurizing step (120) is best explained with reference to FIG. 3, which is a graph of pressure versus temperature and which shows the pressure and temperature conditions required for the clathrate inducing gas to be in a clathrate forming region (300), represented by the cross-hatched area in FIG. 3. In these temperature and pressure conditions the clathrate inducing gas forms a clathrate with the water in the biological tissue. FIG. 3 also illustrates preferred process steps shown by the numbered arrows for hypothermic preservation and recover of a biological tissue according to the invention.

[0050]The non-cross-hatched region in the graph illustrates where the clathrate inducing gas is present as a gas and water is present as a liquid or as a solid (ice). For example when using sulfur hexafluoride as the clathrate forming gas, the phase boundary between the sulfur hexafluoride hydrate clathrate phase and the sulfur hexafluoride gas-water mixture phase is the border of the shaded region running approximately diagonally from the lower left to the upper right. As indicated by this phase boundary, as temperature decreases, the pressure required to effect a phase change from a sulfur hexafluoride gas-water mixture to a sulfur hexafluoride hydrate clathrate also decreases.

[0051]The pressurizing step (120) is preferably performed isothermically and so isothermal pressurization is illustrated by the arrow (301) at a typical ambient temperature of 20 degrees Centigrade. A pressure that will form clathrates inside the cells of the biological tissue at a desired storage temperature in a range of about plus one degree Centigrade to about plus five degrees Centigrade is shown in FIG. 3 as between about 75 pounds per square inch gauge and 100 pounds per square inch gage. This is the same as about 90 pounds per square inch absolute and 115 pounds per square inch absolute.

[0052]It is possible to perform the pressurizing step (120) such that the concentration of the clathrate inducing gas is changed as pressure is increased on the biological tissue. This implementation would not keep the partial pressure of oxygen approximately constant and this is not preferred. Rather, it is preferable that the partial pressure of oxygen in the clathrate inducing gas that is imposed on the biological tissue remain approximately constant as the pressure acting on the biological tissue is increased. For example, if clathrate inducing gas is added to increase the total pressure to 100 pounds per square inch gauge (115 pounds per square inch absolute), then the partial pressure of sulfur hexafluoride or the xenon at the end of this step will be about 112 pounds per square inch absolute, while the partial pressure of oxygen remains at about 3 pounds per square inch absolute. Maintaining the partial pressure of oxygen imposed on the sample approximately constant at the partial pressure of oxygen in Earth's atmosphere at sea level will help to avoid potential damage to the biological tissue caused by a hyperoxic environment or oxygen toxicity.

[0053]FIG. 1 next shows a cooling step (130), which is cooling the biological tissue to the desired storage temperature. The cooling step (130) is preferably performed isobarically, and so isobaric cooling is illustrated by the arrow (302) at the approximate maximum pressure of about 100 pounds per square inch gage. The desired temperature range of about one degree Centigrade to about plus five degrees Centigrade is illustrated under the arrow (303).

[0054]The rate of cooling of the biological tissue may be selected and is not limited by the invention. A preferable range of cooling rates in a range of from +20° C. to +50° C. over a duration from about 15 minutes to about 120 minutes. Selection of a rate of cooling may be influenced by a number of factors. For example, a fast rate of cooling may be selected for a small sample because a small sample of biological tissue would rapidly adjust to the temperature imposed at the wall of the pressure chamber. In another example, a slow rate of cooling might be selected for a large sample, such as a whole organ such as a heart or kidney, because a comparatively long time would be required for a region in the interior of the sample to cool to the desired storage temperature. It is preferable to cool at a rate which permits the biological tissue to maintain approximately a uniform temperature throughout the biological tissue.

[0055]FIG. 1 also shows optional steps that may be added to the above described steps.

[0056]A further cooling step (140) may be added, which involves cooling the biological tissue to a second desired storage temperature warmer than about minus 20 degrees Centigrade, wherein the second desired storage temperature is one at which clathrates would form and remain in the tissue from the clathrate inducing gas at a second storage pressure between about 15 pounds per square inch gauge and 100 pounds per square inch gauge. This further cooling step (140) is best explained with reference to FIG. 3. The clathrate forming region (300) is shown as a cross-hatched area approximately to the left of the zero temperature line represents the temperature and pressure conditions within which the biological tissue may be taken in compliance with this further cooling step (140). The further cooling step (140) is represented by the arrow (304), which may be performed with varying pressure. However, this further cooling step (140) is preferably performed isobarically (131). As can be seen from FIG. 3, the minimum temperature in compliance with this step is about minus 20 degrees Centigrade. Also, in reference to FIGS. 1 and 3, if the second storage pressure is about atmospheric pressure, that is, about 15 pounds per square inch gauge (151), then the warmest that second desired storage temperature compliant with the limitations in this step may be is about minus 10 degrees Centigrade.

[0057]When implementing the optional further cooling step (140), a second pressurization step (150) is required and that is subjecting the biological tissue to the second storage pressure. While it is possible to set the second storage pressure at about the same value as the desired storage pressure attained with above freezing temperatures, it is anticipated that storage at a lesser pressure, such as atmospheric pressure, would be preferable for long time periods. This step is represented by the arrow (305) in FIG. 3.

[0058]However, this second pressurization step (150) is phrased so as to require subjecting the biological tissue to the pressure, rather than stating a depressurization or pressurization step. This would accommodate a situation, for example, where the above freezing storage pressure was 80 pounds per square inch gauge and the second storage pressure was 100 pounds per square inch gauge. It would also accommodate a situation where the above freezing storage pressure was 100 pounds per square inch and the second storage pressure was 80 pounds per square inch.

[0059]Optionally, but preferably, before conducting the optional further cooling step (140), the temperature and pressure imposed on the biological tissue when first cooled are maintained approximately constant for a period of time (isothermal and isobaric conditions). This period of time is a duration over which a large part of the clathrate structure that can form within the biological tissue is formed within the biological tissue. For example, this period of time might be selected as the duration required for 90% of the water available for incorporation in a clathrate to be incorporated in a clathrate. This period of time may be selected on the basis of theoretical or empirical models of the kinetics of clathrate formation and/or by an iterative trial-and-error process conducted on trial samples having the same or similar composition as the biological tissue that is to be hypothermically preserved. For example, such period of time might be selected to be in a range of from about 15 minutes to about 120 minutes.

[0060]Recovery steps are shown in FIG. 2. These are steps that would be added to the hypothermic preservation steps for recovery of the biological tissue to a viable state (200). Reference is also made to FIG. 3.

[0061]The simplest recovery method for hypothermic storage above freezing (zero degrees Centigrade) is one recovery depressurizing step (240) involving depressurizing the biological tissue while warming the biological tissue to a pressure and temperature that restores the tissue to a viable state.

[0062]The best method for recovery of biological tissue involves a recovery flushing step (210) comprising flushing the biological tissue with a recovery gas mixture consisting of helium and oxygen. The helium is in a concentration in the recovery gas mixture within a range of 90 mole percent to 95 mole percent. The oxygen is in a concentration in the recovery gas mixture within a range of about 5 mole percent to 10 mole percent. Flushing displaces the clathrate inducing gas surrounding the biological tissue with recovery gas mixture and permeates the biological tissue, which prevents the biological tissue from abrupt clathrate break-up during the recovery step.

[0063]For recovery of biological tissue stored above freezing (zero degrees Centigrade), flushing preferably takes place at a pressure within a range of 100 pounds per square inch absolute to 120 pounds per square inch absolute (240).

[0064]For recovery of biological tissue stored below freezing, flushing preferably takes place at a pressure that maintains the biological tissue within the clathrate forming region (300) defined by the cross-hatched area in the phase diagram of FIG. 3. Thus, a subjecting step (220) is subjecting the biological tissue to the recovery gas mixture at a recovery pressure that permits the clathrate inducing gas to form clathrates inside the cells of the biological tissue at temperature above zero degrees Centigrade.

[0065]At the start of the recovery process, the biological tissue contains gas hydrates from the clathrate inducing gas. Thus, it is preferable that the recovery process be performed under temperature and pressure conditions that maintain the gas hydrates during the warming process to an above freezing temperature. In this manner, formation of water ice at below freezing temperatures will be prevented. Thus, prior to warming the biological tissue, it should be subjected to a pressure that will maintain the biological tissue in the clathrate forming region (300) shown in the cross-hatched area of FIG. 3.

[0066]In colder than freezing storage, the biological tissue may stored at temperatures between minus 10 and minus 20 degrees Centigrade and thus may be at any storage pressure between about atmospheric pressure and about 100 pounds per square inch gauge. In reference to FIG. 3, it can be readily seen that in order that the biological tissue remain at temperature and pressure conditions in the clathrate forming region (300) during the warming process to an above zero degrees Centigrade temperature, the biological tissue must be subjected to recovery gas mixture at a pressure between about 75 pounds per square inch gauge to about 100 pounds per square inch gauge.

[0067]For example, if the second storage pressure is at atmospheric pressure, then the biological tissue would be repressurized with the recovery gas mixture to a pressure in a range of approximately 75 pounds per square inch gauge to 100 pounds per square inch gauge. Alternatively if the second storage pressure is 100 pounds per square inch gauge, then the tissue may be subjected to a recovery gas mixture at the same pressure, or at any pressure between about 75 pounds per square inch gauge to 100 pounds per square inch gauge. This subjecting recovery step (220) may be performed isothermically and is shown in FIG. 3 as arrow (306).

[0068]Once the biological tissue is subjected to the recovery pressure, a first warming recovery step (230) involves warming the biological tissue to a first recovery temperature above zero degrees Centigrade. This step may be performed isobarically and is shown in FIG. 3 as arrow (307).

[0069]Preferably, the first recovery temperature is between about one degree Centigrade and about five degrees Centigrade, which remains in the clathrate forming region, but the first recovery temperature may be at any above freezing temperature that maintains a viable biological tissue. FIG. 3 illustrates the case where the first recovery temperature is at about 5 degrees Centigrade when the preferred depressurizing step (240) indicated by arrow (308) begins.

[0070]The rate of warming to the first recovery temperature may be selected. For example, the rate of warming might be in a range of from about 1° C. per hour to about 20° C. per hour. An example of factors to be considered when selecting the rate of warming is the rate of heat conduction through the sample and/or the size of the sample. For example, a relatively high rate of warming may be selected for a sample through which heat conducts rapidly and/or that is small. For example, a relatively low rate of warming may be selected for a sample through which heat conducts slowly and/or that is large. The rate of warming may be selected, so that the temperature throughout the biological tissue is relatively constant. Warming of the biological tissue may be achieved by, for example, by conduction, e.g., by increasing the temperature of the gas surrounding or circulating about the sample or increasing the temperature of a wall of a pressure chamber where the process may be carried out.

[0071]A higher rate of warming of the sample while maintaining a similar temperature throughout the sample may be achieved by radiatively heating the sample or using combined radiation and conduction to heat the sample. For example, microwaves may be used to heat the sample. The microwaves can penetrate into the sample to produce heat in the interior of the sample, rather than heat only traveling from the surface of the sample into the interior as with heating by conduction from the wall of the pressure chamber or the surrounding gas. For example, infra-red radiation may be used. Whether radiation is selected for heating the sample, the type of radiation, e.g., microwave or infrared, and the characteristics of the radiation, e.g., wavelength depends on evaluation of a number of factors, such as transparency of regions, e.g., outer layers, of the sample to the radiation and absorbance of regions, e.g., inner regions, of the sample to the radiation.

[0072]The preferred depressurizing step (240) involves depressurizing the biological tissue while warming the biological tissue to a pressure and temperature that restores the tissue to a viable state.

[0073]Alternatively, the recovery process could warm isobarically and then depressurize to atmospheric conditions in two steps. However, controlling the pressure while warming is an unnecessary complication of the process.

[0074]The rate of decrease of pressure and the variation of temperature with decreasing pressure (if temperature is increased while decreasing pressure) may optionally be selected based on a number of factors. For example, the rate of decrease of pressure may be selected to allow gases dissolved in the sample to migrate out of the sample without forming bubbles or with the formation of only small bubbles, with the goal of avoiding the formation of gas bubbles of a size that may damage the sample. If temperature is increased while pressure is decreased, the change in solubility of the gases in the tissue with increased temperature may be considered. The change in solubility of the gases in the tissue with increased temperature may also affect the choice of variation in temperature with decreasing pressure. The selection of the rate of decrease in pressure and/or variation in temperature with decreasing pressure may be guided by theoretical or empirical models, for example, diving decompression tables or by trial-and-error experimentation on trial samples.

[0075]After the preferred depressurizing step (240), the biological tissue may be returned to an environment of atmospheric gases.

[0076]When above freezing hypothermic storage is utilized, the recovery method is similar. The same steps as described above for below freezing storage are involved, except there is no need for a first warming recovery step (230) because the biological tissue is already above freezing. Thus, the recovery flushing step (210); the subjecting recovery step (220); and, the preferred depressurizing step (240) are performed when above freezing hypothermic storage is utilized.

EXAMPLE 1

Hypothermic Preservation of Tissue with Xenon Hydrate Clathrates

[0077]Experiments were performed on 10 albino mice (Mus musculus) (male, 6-8 weeks old; 25±2 gm body weight). The animals were euthanized with Halothane (Sigma-Aldrich; Cat. #B4388) (according to the procedures recommended by the Panel on Euthanasia of the American Veterinary Association) and the hearts were immediately dissected and put into CORNING.RTM. vials (without the caps) containing 200 III of oxygenated modified Krebs-Henselite solution (118.4 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 4.7 mM KCl, 1.6 mM KH2PO.sub.4, 0.6 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 11 mM glucose) to protect the cardiac tissue from drying. Cardiomyocytes serve as a model to study dynamics of mitochondrial damage in clinical and experimental pathology.

[0078]The vials were put inside a pressure chamber, pressurized with xenon-oxygen mixture (90 pounds per square inch xenon; 10 pounds per square inch oxygen) and left on ice for 15 minutes. The control samples were pressurized with nitrogen-oxygen mixture (90 pounds per square inch nitrogen; 10 pounds per square inch oxygen). Then the pressure chambers were put on stands in a styrofoam container over liquid nitrogen for gradual cooling for 15 minutes. During cooling down the pressurized chambers in liquid nitrogen vapor, the pressure dropped due to gas contraction and minor leakage. Subsequently the pressure chambers were immersed in liquid nitrogen for another 15 minutes.

[0079]The pressure chambers with whole murine hearts were warmed at room temperature for 15 minutes and opened. The temperature of the samples was measured using Sper Scientific 800024 Multi-input Thermocouple Thermometers (Cat. #K-9446I-35 from Cole-Parmer Instrument Company, Vernon Hills, Ill.) with the flexible TeflonR-insulated-wire probe. The temperature of the cardiac samples was -94±2.5° C. just after opening the chamber.

[0080]The hardness of the cardiac tissue in the chamber filled with xenon-oxygen mixture under pressure was different in comparison with control cardiac samples which were straight frozen in liquid nitrogen. The cardiac samples were firm and were easily cut with a blade, but not stone-hard as in a control sample, which was straight frozen in liquid nitrogen under normal pressure conditions.

[0081]To investigate the extent of the damage of the cardiac tissue after application of the method of the invention involving colder than freezing storage, (based on using a clathrate inducing gas of xenon and oxygen) and the controls frozen under the pressurized nitrogen-oxygen mixture, transmission electron microscopy of the cardiac tissue was performed.

[0082]The heart tissue specimens (3?3?3 mm) were cut from the apex and immediately fixed in cold (+4° C.) 2.5% glutaraldehyde in 0.1M Sorensen's sodium buffer (Electron Microscopy Sciences; Cat. #15980) (the cardiac samples were thawed at room temperature to 0° C. before putting them in a fixative to avoid any fixation artifacts). Samples were post-fixed with 1% osmium tetroxide in the same buffer for one hour at room temperature, and then washed three times with the same buffer and three times with distilled water. Samples were stained en bloc with 0.5% uranyl acetate for two hours at room temperature, then washed three times with distilled water and gradually dehydrated with ethanol before being transferred to acetone. Spurrs epoxy resin was used for infiltration and blocks were polymerized for 48 hours at 60° C. Thin-sections were cut on a LEICA Ultracut R microtome and post-stained with uranyl acetate and lead citrate. Samples were observed and recorded at 80 kV accelerating voltage on a Philips CM-12 Scanning Transmission Electron Microscope (the Netherlands) at the Electron Microscopy and W. M. Keck Bioimaging Laboratory at Arizona State University. Images were recorded digitally on a Gatan 791 charge-coupled device camera (Gatan, Inc., Warrendale, Pa.).

[0083]Electron microscopy of the cardiac tissues showed obvious and significant differences in the cardiomyocytes' mitochondria structures from the different cryopreservation protocols. There was the presence of irreversible cellular membrane damage (such as disruption of myofibrils and cytoplasmic membrane invaginations) of the cardiac myocytes that were straight frozen in liquid nitrogen under normal pressure. Furthermore, there was decreased density of the mitochondrial matrix in cardiomyocytes cryopreserved with the high pressure nitrogen-oxygen gas mixture and cooled in liquid nitrogen. By contrast, relatively well-preserved mitochondria were present in cardiac myocytes of the cardiac samples after using the method of the invention.

[0084]Comparative analysis of structural changes in mitochondria revealed a strong diminution in density of the mitochondrial matrix in the cardiac samples which were straight frozen in liquid nitrogen, compared with the treated cardiac samples. Densitometry of the mitochondrial matrix was performed using lmagej software (NIH; http://rsb.info.nih.gov/ij/). Density of the mitochondrial matrix in mitochondria was normalized against the ribosomes of the rough endoplasmic reticulum. Statistical analysis was done by Student's t-test; values are mean ±Standard Deviation (S.D.). A p-value of less than 0.05 was considered statistically significant. The density of the mitochondrial matrix in the cardiac samples hypothermically preserved using a clathrate inducing gas of xenon and oxygen was much higher (almost like in the intact cardiac tissue) than in cardiomyocyte mitochondria in the samples that were frozen in the pressurized nitrogen-oxygen mixture. A p-value of less than 0.05 indicated a statistically significant difference between the densities observed in the samples hypothermically preserved using a clathrate inducing gas of xenon and oxygen according to the invention, compared with the samples frozen in the pressurized nitrogen-oxygen mixture. Approximately 76% of mitochondria of the cardiac samples that underwent hypothermic preservation process of the invention had the same density as the reference cardiac samples. The structure of capillary endothelial cells was relatively well preserved after employing the method of the invention involving below freezing storage.

[0085]No mitochondrial swelling, rupture of inner and outer membranes, or leakage of mitochondrial matrix into the cytoplasm was observed in the tissue samples that underwent hypothermic preservation according to the process of the invention. In the control cardiac samples (after straight freezing under high pressure in nitrogen-oxygen mixture at 100 pounds per square inch), electron microscopy demonstrated fragmentation of the mitochondrial inner membrane, rupture of inner and outer membranes, and leakage of mitochondrial matrix into the cytoplasm.

[0086]Electron microscopy showed diffuse endothelial cell damage and marked perivascular space edema in the cardiac samples after straight freezing in liquid nitrogen under normal pressure. Extensive capillary damage was in cardiac tissue after incubation at high-pressure nitrogen-oxygen gas mixture and cooling in liquid nitrogen as well. By contrast, the structure of capillary endothelial cells was relatively well preserved after following the hypothermic preservation process of the invention.

[0087]Hypothermic preservation of tissue with xenon-oxygen hydrate clathrates may protect tissues by retention of water inside the cells by clathrate formation of the water with the introduced gases, limiting the formation of ice outside the cells. Xenon forms clathrates above 0° C. under relatively low pressure.

[0088]Xenon has high skin permeability. Using xenon under high pressure (which is highly permeable) may prevent cells from freezing damage caused by intracellular dehydration. The use of a high pressure xenon-oxygen mixture, according to the invention, resulted in the absence of the following cellular damage: mitochondrial swelling; rupture of inner and outer membranes; and, leakage of mitochondrial matrix into the cytoplasm. In contrast, freezing under high nitrogen pressure exhibited such cellular damage. Others have demonstrated that loss of mitochondrial membrane potential leads to mitochondrial swelling and it is well known that permanent ischemia causes loss of matrix density, and this is associated with mitochondrial swelling.

[0089]Another important sign of severe cellular damage is invagination of the cytoplasmic membrane. This was seen in our control cardiac samples after straight freezing in liquid nitrogen. This morphologic finding indicates membrane damage.

[0090]Mitochondrial volume homeostasis is a housekeeping function that is essential for maintaining the structural integrity of the organelle. Mitochondrial swelling is also one of the key players in cytochrome c release associated with apoptotic cell death. Measurement of the concentration of cardiolipin may be done to assess mitochondrial damage. In intact cells, the cellular distribution of cardiolipin is restricted to mitochondria. The detection of cardiolipin outside of mitochondria is a sign of severe mitochondrial membrane damage. Intercellular freezing can cause cellular damage in the course of thawing, during which re-crystallization can occur. In contrast, xenon gas hydrate clathrates formed according to the invention are easily broken as the pressure drops, without intracellular water re-crystallization.

EXAMPLE 2

Recovered Biological Tissue Having a Biopreservation Marker

[0091]In an embodiment, a recovered biological tissue sample, previously hypothermically preserved at a temperature of between -10° C. and -20° C., has a temperature of at least +50° C. and exhibits metabolism. The recovered biological tissue preferably has a biopreservation marker in a measureable quantity. The measureable quantity of the biopreservation marker may be distinct from a quantity in the biological tissue exhibiting metabolism prior to hypothermic preservation. For example, the biopreservation marker may be cardiolipin or lactate dehydrogenase.

EXAMPLE 3

Recovery of Hypothermically Preserved Tissue without Recompression

[0092]The solubility characteristics of the clathrate-forming gas used in hypothermically preserving the tissue may affect the amount of gas dissolved in the sample. For example, sulfur hexafluoride has a lower solubility in biological tissue than xenon. When tissue hypothermically preserved with xenon is warmed without flushing and repressurization with a gas such as a helium-oxygen mixture, bubbles of xenon gas can form in the tissue, and can cause damage to the tissue.

[0093]In contrast, because of the lower solubility in biological tissue of sulfur hexafluoride, tissue hypothermically preserved with sulfur hexafluoride may be warmed without flushing and repressurization without the formation of sulfur hexafluoride bubbles in the tissue for a broader range of conditions of the hypothermically preserved tissue (e.g., range of temperature of hypothermic preservation and/or pressure of clathrate-forming gas imposed on the tissue during hypothermic preservation).

EXAMPLE 4

Formation of Xenon Hydrate Clathrates in Animals

[0094]Trials were performed in which a gaseous mixture including xenon (about 90 mol %), nitrogen (about 8 mol %), and oxygen (about 2 mol %) at a total pressure of about 50 pounds per square inch was imposed on live Planaria organisms at a temperature of +50° C. Xenon clathrate formation in the tissues of the Planaria was observed. The high-pressure container in which the Planaria were held included a glass window as an observation port. Through the observation port, a change in color of the Planaria tissue to a cotton-like appearance was indicative of the formation of xenon clathrate hydrate; the appearance was distinct from that of frozen tissue in which intracellular ice has formed. Moreover, an observed cessation of movement of the Planaria organisms was associated with the formation of xenon clathrate hydrate in tissue.

[0095]After the pressure was released and the Planaria were returned to air at atmospheric pressure, the xenon clathrate hydrate observed in the tissue of the Planaria was observed to have dissipated; a change in color of the Planaria tissue was observed. Furthermore, after the pressure was released and the Planaria were returned to air at atmospheric pressure, the Planaria were observed from their movement to be alive and survived for about 24 hours. This indicated that the procedure of forming xenon clathrate hydrates in Planaria was reversible, and that Planaria hypothermically preserved through the formation of xenon clathrate hydrates were viable.

EXAMPLE 5

Formation of Sulfur Hexafluoride Hydrate Clathrates in Animals

[0096]Trials were performed in which a gaseous mixture of sulfur hexafluoride at a partial pressure of 90 pounds per square inch and oxygen at a partial pressure of 10 pounds per square inch (for a total pressure of 100 pounds per square inch) was imposed on live Planaria organisms. The Planaria organisms under the gaseous mixture were cooled on ice to a temperature of about 0° C. Sulfur hexafluoride clathrate formation in the tissues of the Planaria was observed. The high-pressure container in which the Planaria were held included a glass window as an observation port. Through the observation port, a change in color of the Planaria tissue to a cotton-like appearance was indicative of the formation of sulfur hexafluoride clathrate hydrate; the appearance was distinct from that of frozen tissue in which intracellular ice has formed. Moreover, an observed cessation of movement of the Planaria organisms was associated with the formation of sulfur hexafluoride clathrate hydrate in tissue.

[0097]After the pressure was released and the Planaria were returned to air at atmospheric pressure, the sulfur hexafluoride clathrate that had been observed in the tissue of the Planaria was observed to have dissipated; a change in color of the Planaria tissue was observed. Furthermore, after the pressure was released and the Planaria were returned to air at atmospheric pressure, the Planaria were observed from their movement to be alive and survived for about 24 hours. This indicated that the procedure of forming sulfur hexafluoride clathrates in Planaria was reversible, and that Planaria hypothermically preserved through the formation of sulfur hexafluoride clathrate hydrates were viable.

EXAMPLE 6

Hypothermic Preservation of Animals with Sulfur Hexafluoride or Xenon Hydrate Clathrates and Recovery

[0098]A clathrate-forming gas, e.g., sulfur hexafluoride and/or xenon, may be used to reversibly hypothermically preserve organisms and animals. For example, a clathrate inducing gas under pressure, e.g., a mixture of sulfur hexafluoride at a partial pressure of about 90 pounds per square inch and oxygen at a partial pressure of about 10 pounds per square inch (for a total pressure of 100 pounds per square inch) or a mixture of xenon at a partial pressure of about 90 pounds per square inch and oxygen at a partial pressure of about 10 pounds per square inch (for a total pressure of 100 pounds per square inch), may be imposed on an organism such as an animal, e.g., Planaria, in a high-pressure chamber. The high-pressure chamber with the organism, e.g., Planaria, may be cooled on ice for about 1 hour, say, to a temperature approaching 0° C. The high-pressure chamber with the organism, e.g., Planaria, can then be cooled to a temperature of about -20° C., the pressure of the clathrate inducing gas may be released, and the organism, e.g., Planaria, in the high-pressure chamber may be exposed to air in the atmosphere. The high-pressure chamber with the organism, e.g., Planaria, may be maintained as hypothermically preserved at -20° C. for an extended period of time, for example, one week.

[0099]The hypothermically preserved organism, e.g., Planaria, can then be recovered, for example, as follows. The high-pressure chamber with the organism, e.g., Planaria, may be flushed with a mixture of an inert gas and oxygen, for example, with helium at a partial pressure of about 90 pounds per square inch and oxygen at a partial pressure of about 10 pounds per square inch, to remove the clathrate forming gas, e.g., sulfur hexafluoride and/or xenon, from the biological tissues of the animal. The temperature of the high-pressure chamber with the organism, e.g., Planaria, can then be gradually increased with time, for example, to room temperature, e.g., about +20° C. As the temperature is increased, the pressure may be gradually decreased. Such flushing followed by gradual warming and depressurization may be used to avoid the formation of gas bubbles in the organism that could be harmful to tissue. The organism, e.g., Planaria, can then be removed from the chamber and exposed to air at atmospheric pressure and room temperature. The state of the organism, for example, its life functions, may be investigated.

EXAMPLE 7

Hypothermic Preservation of Animal Organs with Sulfur Hexafluoride or Xenon Hydrate Clathrates and Recovery

[0100]A clathrate-forming gas, e.g., sulfur hexafluoride and/or xenon, may be used to reversibly hypothermically preserve whole organs or parts of organs from animals. For example, a clathrate inducing gas under pressure, e.g., a mixture of sulfur hexafluoride at a partial pressure of about 90 pounds per square inch and oxygen at a partial pressure of about 10 pounds per square inch (for a total pressure of 100 pounds per square inch) or a mixture of xenon at a partial pressure of about 90 pounds per square inch and oxygen at a partial pressure of about 10 pounds per square inch (for a total pressure of 100 pounds per square inch), may be imposed on an organ such as a heart, kidney, or liver. The high-pressure chamber with the organ may be cooled on ice for about 1 hour, say, to a temperature approaching 0° C. The high-pressure chamber with the organ can then be cooled to a temperature of about -20° C., the pressure of the clathrate inducing gas may be released, and the organism, e.g., Planaria, in the high-pressure chamber may be exposed to air in the atmosphere. The time for cooling the organ and releasing the pressure may be varied, depending, for example, on the size of the organ. For example, a small organ sample, e.g., some cells, may require less than 24 hours. For example, a whole internal organ, such as a heart, kidney, or liver, may require as much as 48 hours or 72 hours. The high-pressure chamber with the organ may be maintained as hypothermically preserved at -20° C. for an extended period of time, for example, one week.

[0101]The hypothermically preserved organ can then be recovered, for example, as follows. The high-pressure chamber with the organ may be flushed with a mixture of an inert gas and oxygen, for example, with helium at a partial pressure of about 90 pounds per square inch and oxygen at a partial pressure of about 10 pounds per square inch, to remove the clathrate forming gas, e.g., sulfur hexafluoride and/or xenon, from the biological tissues of the organ. The temperature of the high-pressure chamber with the organ can then be gradually increased with time, for example, to room temperature, e.g., about +20° C. As the temperature is increased, the pressure may be gradually decreased. Such flushing followed by gradual warming and depressurization may be used to avoid the formation of gas bubbles in the organ that could be harmful to tissue. The organ, e.g., heart, kidney, or lung, can then be removed from the chamber and exposed to air at atmospheric pressure and room temperature. The viability of the organ, for example, its metabolism, may be investigated. Such a procedure of hypothermically preserving and then recovering an organ could be useful, for example, in human organ transplantation procedures.

[0102]The embodiments illustrated and discussed in this specification are intended only to teach those skilled in the art the best way known to the inventors to make and use the invention. Nothing in this specification should be considered as limiting the scope of the present invention. All examples presented are representative and non-limiting. The above-described embodiments of the invention may be modified or varied, without departing from the invention, as appreciated by those skilled in the art in light of the above teachings. It is therefore to be understood that, within the scope of the claims and their equivalents, the invention may be practiced otherwise than as specifically described.

[0103]The above-described embodiments including the drawings are examples of the invention and merely provide illustrations of the invention. Other embodiments will be obvious to those skilled in the art. Thus, the scope of the invention is determined by the appended claims and their legal equivalents rather than by the examples given.

IDUSTRIAL APPLICABILITY

[0104]The invention may be used in the medical industry to store human blood components for transfusion, such as human blood platelets, and human organs for transplantation, such as hearts, kidneys, and livers. The invention may also be used in the food industry for high-quality preservation of food, such as seafood.